Uso de “Plant Preservative Mixture” en el establecimiento in vitro de Sprekelia formosissima (L.) Herb. (Amaryllidaceae)

Abstract

Sprekelia formosissima (L.) Herb. is a bulbous and perennial species with red flowers. The in vitro establishment of bulbous species presents a high contamination index. The objective was to establish the adequate time of immersion of Sprekelia formosissima (L.) Herb. bulbs that allows its aseptic establishment through use of “Plant Preservative Mixture” (PPM) and to and to compare different types of cut for the multiplication of bulbs stimulating the growth and development of bulblets. Bulbs were washed in compound solution of benzalkonium chloride 10 g L-1 and placed in disinfectant solutions: a) benomyl 50% 1 gL-1/5 min; b) 480 Metalaxyl-M 1 gL-1/5 min; c) copper sulfate pentahydrate 90.9%, gentamicin sulfate 2.3%, and oxytetracycline hydrochloride 6.8% 1 grL-1/1 h; and d) calcium hypochlorite 2% / 30 min. 15 mL-1 PPM was applied for 6, 12 or 24 hours and a distilled sterile water control. A bulb was placed in culture flasks with Murashige and Skoog (1962) medium added with benzyladenine (BA 3 mgL-1), naphthaleneacetic acid (ANA, 0.5 mgL-1) and PPM (2 mL). From the contaminated unit, mycelium was cut and seeded on potato-dextrose-agar (PDA) with antibiotic (penicillin) (8 μl L-1), acaricide (8 μl L-1), and lactic acid (6 μl L-1). For the multiplication of bulbs, two types of cuts were used: cross-section and a longitudinal-section. Immersion in PPM for 12 h allowed obtaining 75% aseptic bulbs. The contaminating agents were identified: Fusarium, Rhizopus, Trichoderma, Alternaria. It was possible to purify three fungal strains: Fusarium sp, Fusarium oxysporum, Trichoderma sp. The type of cut had a significant effect on the number of bulblets per stem bulb, in the cross-section 0.4 bulbs were obtained per explant, while in the longitudinal-section 1.9 bulbs were obtained, it is attributed to the fact that the basal disk is located in contact with the nutrient medium.

Sprekelia formosissima (L.) Herb. es una especie bulbosa y perenne con flores rojas. El establecimiento de especies bulbosas in vitro presenta un índice de contaminación elevado. El objetivo fue establecer el tiempo adecuado de inmersión de bulbos de Sprekelia formosissima (L.) Herb. que permita su establecimiento aséptico mediante el uso de “Plant Preservative Mixture” (PPM) y comparar tipos de corte para la multiplicación de bulbos. Bulbos se lavaron en solución compuesta por cloruro de benzalconio 10 g L-1 y colocaron en soluciones desinfectantes: a) benomilo 50% 1 gL-1/5 min; b) 480 Metalaxil-M 1 gL-1/5 min; c) sulfato de cobre pentahidratado 90.9%, sulfato de gentamicina 2.3%, y clorhidrato de oxitetraciclina 6.8% 1 grL-1/1 h; y d) hipoclorito de calcio 2%/30 min. Se aplicó PPM 15 mL durante 6, 12 o 24 horas y un control de agua destilada estéril. Se colocó un bulbo en frascos de cultivo con medio Murashige y Skoog (1962) adicionado con benciladenina (BA 3 mgL-1), ácido naftalenacético (ANA, 0.5 mgL-1) y PPM (2 mL). De la unidad contaminada, se cortó y sembró micelio en papa-dextrosa-agar (PDA) con antibiótico (penicilina) (8 μl L-1), acaricida (8 μl L-1), y ácido láctico (6 μl L-1). Para la multiplicación de bulbos se usó dos tipos de cortes: transversal y longitudinal. La inmersión en PPM durante 12 h permitió obtener 75% de bulbos asépticos. Los agentes contaminantes, principalmente hongos, se identificaron como Fusarium, Rhizopus, Trichoderma y Alternaria. Se lograron purificar tres cepas fúngicas puras (Fusarium sp, Fusarium oxysporum y Trichoderma sp). El tipo de corte tuvo un efecto significativo para el número de bulbillos por bulbo madre, en el corte transversal se obtuvo 0.4 bulbos por explante, mientras que en el corte longitudinal se obtuvo 1.9 bulbos, se atribuye a que el disco basal se encuentra en contacto con el medio nutritivo.