Estado funcional de la membrana plasmática y sobrevivencia del espermatozoide caprino incubado en medio TBM

Abstract

In this study was determined the functional state of the plasma membrane and survival of sperm goat incubated in medium TBM. Were collected 7 ejaculates of semen goats Saanen, by artificial vagina; obtaining 0.5-1.0 ml of semen collection. Once the ejaculate was obtained two washes were performed to remove seminal plasma, using the solution mDM (Modified Dulbeccoˊs Medium); washes consisted of centrifuging the sample at 1300 rpm for 4 minutes at room temperature, the supernatant was removed and replenished with equal volume of mDM incubated in a 45 ° angle for 45 minutes at 37 ° C in an atmosphere of 5 % CO2 (Tecnic Swim up). After this time they were taken 500 μL of the supernatant and diluted into 1.5 ml of mDm more heparin (100ug/ml) and was incubated for 15 minutes at 37 ° C. subsequently taken 10μl from this sample and diluted in 10 ml of water for sperm count and sperm count obtain the amount deposited in tubes Eppendorf with means TALP and TBM, respectively. To observe the functional state of the plasma membrane, an aliquot of semen incubated in media TALP and TBM was taken and chlortetracycline staining (CTC) was performed at 0, 3, 6, 20 and 24 hrs after the process started. A minimum of 60 sperm cells per smear of CTC were counted. According to the staining pattern CTC fluorescent the sperm count were classified in incapacitated, capacitated and reacted. The average ± S.D. with TALP for capacitated sperm was 47.7 ± 20.4, incapacitated 32.9 ± 26.4 and reacted 19.2 ± 20.5; with TBM for capacitated was 48.8 ± 23.4, incapacitated 29.4 ± 29.2 and reacted 21.7 ± 22.4. No significant differences (p˂0.05) between the two media were found.

En el presente trabajo se determinó el estado funcional de la membrana plasmática y sobrevivencia del espermatozoide caprino incubado en medio TBM. Se colectaron 7 eyaculados de semen de caprino de la raza Saanen, mediante vagina artificial; obteniendo de 0.5-1.0 ml de semen por colecta. Una vez que se obtuvo el eyaculado se practicaron dos lavados para retirar el plasma seminal, utilizando la solución mDM (Modified Dulbecco´s Medium); los lavados consistieron en centrifugar la muestra a 1300 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante fue eliminado y repuesto con igual volumen de mDM incubándose en un ángulo de 45° durante 45 minutos a 37° C en una atmósfera de 5% CO2 (Técnica Swim up). Transcurrido este tiempo se tomaron 500 μL del sobrenadante y se diluyeron en 1.5 ml de medio mDM más heparina (100μg/ml) y se incubo durante 15 minutos a 37° C. Posteriormente se tomaron 10 μL de esta muestra y se diluyeron en 10 ml de agua para realizar el conteo espermático y obtener la cantidad de espermatozoides a depositar en tubos eppendorf con los medios TBM y TALP, respectivamente. Para observar el estado funcional de la membrana plasmática, se tomó una aliquota del semen incubado en TBM y TALP y se realizó la tinción con clortetraciclina (CTC) a las 0, 3, 6, 20 y 24 hrs después de iniciado el proceso; se contaron un mínimo de 60 células espermáticas por frotis de CTC. Según el patrón de tinción CTC fluorescente los espermatozoides se clasificaron en: no capacitados, capacitados y reaccionados. El promedio ± DS con TALP para espermatozoides capacitados fue de 47.7±20.4, no capacitados 32.9±26.4 y reaccionados 19.2±20.5; con TBM para capacitados fue de 48.8±23.4, no capacitados 29.4±29.2 y reaccionados 21.7±22.4. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre ambos medios.