Inversión de sacarosa de jugo de caña de azúcar por acción de una invertasa termoestable de Thermotoga marítima

Abstract

The objective of this research was the expression of a recombinant invertase in Escherichia coli and its biochemical characterization (optimal operating conditions and kinetic parameters KM and Vmax) for the hydrolysis of sucrose. The enzyme invertase (EC 3.2.1.26), an exo-β-D-fructofuranosidase that catalyzes the hydrolysis of sucrose produces an equimolar mixture of glucose and fructose is known as invert sugar. The brfA gene encodes a bacterium Thermotoga maritima invertase whose sequence consists of 432 amino acids and has a molecular weight of 50 kDa and belongs to the family GH32. An interesting feature of this invertase is not required metal as cofactors. The brfA gene was amplified by PCR using TRC-BRF-F1 oligonucleotides (5'CGA-TGA-GCT-CAT-GTT-CAA-GCC-GAA-TTA-TCAC3 ') and TRC-BRF-R1 (5 'GCT-AAG-ATC-TAG-TGT-TGG-TAT-ACA-AGA-G3'). The generated fragment was subcloned into the plasmid pTrcHis2 A between restriction sites BamH I and Hind III. The resulting plasmid pTrcHis2AInu is used to transform competent E. coli TOP10 cells and express the enzyme invertase. The concentration of invertase purification obtained cell extract was purified 223,173 g / mL. The concentration of reducing sugars was determined by the method of 3,5-dinnitrosalicílico acid. The enzyme assay was carried out in commercial sucrose and raw cane juice sugar and demineralised. The test cane juice crude showed a decrease in hydrolysis due to the inhibitory effect of some compounds present in the substrate. Invertase showed a notable increase in activity in the demineralised juice.

El objetivo de este trabajo de investigación fue la expresión de una invertasa recombinante en Escherichia coli y su caracterización bioquímica (condiciones óptimas de operación y los parámetros cinéticos KM y Vmax) para la hidrólisis de sacarosa. La enzima invertasa (EC 3.2.1.26), una exo-β-D-fructofuranosidasa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa produce una mezcla equimolar de glucosa y fructosa que se conoce como azúcar invertido. El gen brfA de la bacteria Thermotoga maritima codifica una invertasa cuya secuencia consta de 432 aminoácidos y tiene un peso molecular de 50 kDa, y pertenece a la familia GH32. Una característica interesante de esta invertasa es que no requiere de metales como cofactores. El gen brfA se amplificó mediante la técnica de PCR usando los oligonucleótidos TRC-BRF-F1 (5’CGA-TGA-GCT-CAT-GTT-CAA-GCC-GAA-TTA-TCAC3’) y TRC-BRF-R1 (5’GCT-AAG-ATC-TAG-TGT-TGG-TAT-ACA-AGA-G3’). El fragmento generado se subclonó en el plásmido pTrcHis2 A entre los sitios de restricción BamH I y Hind III. El plásmido resultante pTrcHis2AInu se utilizó para transformar células competentes de E. coli TOP10 y expresar la enzima invertasa. La concentración de invertasa obtenida de la purificación del extracto celular purificado fue de 223.173 μg/mL. La concentración de azúcares reductores se determinó por el método del ácido 3,5-dinnitrosalicílico. El ensayo enzimático fue efectuado en sacarosa comercial y jugo de caña de azúcar crudo y desmineralizado. El ensayo en jugo de caña crudo mostró una disminución en la hidrólisis debido al efecto inhibitorio de algunos compuestos presentes en el sustrato. La invertasa mostró un notable incremento en su actividad en el jugo desmineralizado.