Sobreexpresión y purificación del producto del gen chrB del plásmido pUM505 de Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Plasmid pUM505 of Pseudomonas aeruginosa has the chara gene encoding the membrane protein CHRA 416 amino acids (aa) which confers resistance to chromate through an ejection system, mediated by the membrane potential. Similarly, resistance Cupriavidus metallidurans CH34 chromate is encoded by the gene from plasmid pMOL28 CHRA. C. chr operon gene metallidurans CHRA also has the ChrB, CHRC, CHRF chre and also genes involved in resistance to chromate. It has been proposed that the ChrB gene encoding C. metallidurans ChrB protein that functions as a transcriptional regulator of resistance to chromate and whose absence causes increased accumulation and hypersensitivity ion. Plasmid pUM505 of P. aeruginosa has CHRA gene adjacent to one ChrB gene, which encodes a hypothetical protein called ChrB of 296 aa. ChrB has aa 44% identical with the protein C. ChrB metallidurans. The presence of a gene homologous to the C. ChrB metallidurans in pUM505 plasmid P. aeruginosa ChrB suggests that the gene may encode pUM505 a regulatory protein involved in resistance to chromate in P. aeruginosa. The aim of this work was to overexpress and purify the protein encoded in the ChrB pUM505 P. aeruginosa plasmid. For purification of ChrB protein, ChrB gene was cloned into the expression vector pQE31 which adds a label six histidine (6xHis) at the amino terminus of ChrB obtaining the recombinant protein ChrB-His and transferred to Escherichia coli. Was carried out expression of the recombinant protein ChrB-His using different concentrations of the inducer IPTG (isopropyl ?-D thiogalactopyranoside), varying the time and temperature induction.

El plásmido pUM505 de Pseudomonas aeruginosa posee el gen chrA que codifica la proteína de membrana ChrA de 416 aminoácidos (aa) la cual confiere resistencia a cromato a través de un sistema de expulsión, mediado por el potencial de membrana. De igual manera, la resistencia a cromato en Cupriavidus metallidurans CH34 es codificada por el gen chrA del plásmido pMOL28. El operón chr de C. metallidurans además del gen chrA posee los genes chrB, chrC, chrE y chrF también involucrados en la resistencia a cromato. Se ha propuesto que el gen chrB de C. metallidurans codifica la proteína ChrB que funciona como un regulador transcripcional de la resistencia a cromato y cuya ausencia ocasiona un aumento en la acumulación e hipersensibilidad al ión. El plásmido pUM505 de P. aeruginosa posee aledaño al gen chrA un gen chrB, el cual codifica una proteína hipotética denominada ChrB de 296 aa. ChrB presenta 44% de aa idénticos con la proteína ChrB de C. metallidurans. La presencia de un homólogo al gen chrB de C. metallidurans en el plásmido pUM505 de P. aeruginosa sugiere que el gen chrB de pUM505 puede codificar una proteína reguladora involucrada en la resistencia a cromato en P. aeruginosa. El objetivo de este trabajo fue sobreexpresar y purificar a la proteína ChrB codificada en el plásmido pUM505 de P. aeruginosa. Para lograr la purificación de la proteína ChrB, el gen chrB fue clonado en el vector de expresión pQE31 que añade una etiqueta de seis histidinas (6xHis) en el extremo amino de ChrB obteniendo la proteína recombinante ChrB-His y se transfirió a cepas de Escherichia coli. Se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante ChrB-His empleando diferentes concentraciones del inductor IPTG (isopropil ?-D tiogalactopiranósido), variando el tiempo y la temperatura de inducción.