Evaluación de la técnica de análisis de alta resolución de la curva de disociación en la búsqueda de mutaciones puntuales en el genoma mitocondrial humano

Abstract

Mitochondria are essential for eukaryotic cells that perform mainly because ATP synthesis via oxidative phosphorylation, have their own genetic material and are involved in other processes such as metabolism and apoptosis. The deterioration in the functions of mitochondria has been implicated in a wide variety of human diseases including cancer. In the last ten years we have found mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) in different types of cancer and some of these mutations have been proposed as molecular biomarkers of certain cancers. The aim of this study was to evaluate the usefulness of high-resolution analysis of the dissociation curve (HRM) in the detection of point mutations in the mtDNA using fragments of about 300 base pairs (bp). DNA samples from blood and biopsy of 3 patients with cervical cancer (cervical cancer) were used, in addition to blood DNA samples from two healthy individuals belonging to two different mitochondrial haplogroups. The latter were used to standardize the conditions for the detection of point mutations by HRM. An initial search of mutations was performed by sequencing of mtDNA some regions of the samples. In addition, a set of primers was designed to search for mutations by HRM. From this set of primers were selected 3 pairs to find some single nucleotide polymorphisms (SNPs) of mitochondrial haplogroups diagnostic, and compared with the results obtained by sequencing. 3 different initial concentrations of temperate and 3 degrees of purity of primers were evaluated. By sequencing no mutation was detected in the sequenced regions of mtDNA CaCu patient.

Las mitocondrias son indispensables para las células eucariotas debido principalmente a que realizan la síntesis de ATP a través de la fosforilación oxidativa, poseen su propio material genético y participan en otros procesos como el metabolismo y la apoptosis. El deterioro en las funciones de la mitocondria ha sido implicado en una amplia variedad de patologías humanas incluyendo el cáncer. En los últimos diez años se han encontrado mutaciones en el ADN mitocondrial (mtADN) en distintos tipos de cáncer y algunas de estas mutaciones han sido propuestas como biomarcadores moleculares de ciertos tipos de cáncer. El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad del análisis de alta resolución de la curva de disociación (HRM) en la detección de mutaciones puntuales en el mtADN utilizando fragmentos de alrededor de 300 pares de base (pb). Se utilizaron muestras de ADN de sangre y de biopsia de 3 pacientes de cáncer cervicouterino (CaCu), además de muestras de ADN de sangre de dos individuos sanos pertenecientes a dos haplogrupos mitocondriales distintos. Estos últimos se utilizaron para estandarizar las condiciones necesarias para la detección de mutaciones puntuales mediante HRM. Se realizó una búsqueda inicial de mutaciones mediante la secuenciación de algunas regiones del mtADN de las muestras. Además, se diseñó un set de primers para realizar la búsqueda de mutaciones mediante HRM. De este set de primers, fueron seleccionados 3 pares para buscar algunas polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) diagnósticas de los haplogrupos mitocondriales, y compararlo con los resultados obtenidos mediante secuenciación. Se evaluaron 3 distintas concentraciones iniciales de templado y 3 grados de pureza de primers. Mediante secuenciación no se detectó ninguna mutación en las regiones secuenciadas del mtADN de pacientes de CaCu.