Identificación de genes del plásmido pUM505 involucrados en la resistencia de quinolonas

Abstract

Structural changes to quinolones of the second generation contributed to these present a broad spectrum, increased activity and good tolerance by promoting a wide diffusion in the clinical area and the subsequent emergence of resistance mechanisms in Gram-negative and positive bacteria encoded on chromosome and / or plasmids. They have identified resistance mechanisms in most bacteria against which the quinolone used, protruding the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa in recent years has increased significantly the resistance to antibiotics used to treat infections caused . Mechanisms quinolone resistance of P. aeruginosa identified at present are encoded on the chromosome, without reporting mechanisms encoded on plasmids. However, it has been determined that pUM505 conjugative plasmid isolated from a strain of P. aeruginosa clinical origin to be transferred to the reference strain P. aeruginosa PAO1 of conferring resistance to quinolones. However, during the computer analysis of its nucleotide sequence not related to antibiotic resistance genes they were identified. So the aim of this study was to identify genes involved in plasmid pUM505 quinolone resistance. an in silico genes encoding proteins pUM505 hypothetical looking those proteins present probable transmembrane segments and a probable membrane and periplasmic cell location to enable them to be part of a transport mechanism analysis. Based on the in silico analysis Orf35, 36 and 37 pUM505 operon encoded in a selected 11 genes. PCR fragment was obtained Orf's said. This fragment was cloned into the pJET 1.2 / blunt vector and subsequently subcloned into the expression vector pUCP20 (binary vector E.coli / P. Aeruginosa).

Las modificaciones estructurales realizadas en quinolonas de la segunda generación contribuyeron a que estas presentaran un amplio espectro, mayor actividad y buena tolerancia propiciando una amplia difusión en el área clínica y la subsecuente aparición de mecanismos de resistencia en bacterias Gram-negativas y positivas codificados en cromosoma y/o plásmidos. Se han identificado mecanismos de resistencia en la mayoría de las bacterias contra las que se emplean las quinolonas, sobresaliendo el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa que en los últimos años ha incrementado de manera importante la resistencia a los antibióticos usados en el tratamiento de las infecciones que provoca. Los mecanismos de resistencia a quinolonas de P. aeruginosa identificados en la actualidad son codificados en el cromosoma, sin haberse reportado mecanismos codificados en plásmidos. Sin embargo, se ha determinado que el plásmido conjugativo pUM505, aislado de una cepa de P. aeruginosa de origen clínico al ser transferido a la cepa de referencia de P. aeruginosa PAO1 confiere resistencia a quinolonas. No obstante, durante el análisis informático de su secuencia de nucleótidos no se identificaron genes relacionados con la resistencia a antibióticos. Por lo que el objetivo de este trabajo fue identificar los genes del plásmido pUM505 que participan en la resistencia a quinolonas. Se realizó un análisis in silico de los genes de pUM505 que codifican proteínas hipotéticas, buscando aquellas proteínas que presentaran probables segmentos transmembranales y una probable localización celular membranal y periplásmica que les permita formar parte de un mecanismo de transporte. Con base en el análisis in silico se seleccionaron los Orf35, 36 y 37 de pUM505 codificados en un operón de 11 genes. Mediante PCR se obtuvo el fragmento de dichos Orf´s. Este fragmento se clonó en el vector pJET 1.2/blunt y posteriormente se subclonó en el vector de expresión pUCP20 (vector binario E. coli/P. aeruginosa).