Construcción de un vector de expresión para el dominio ARF del gen ARD1/TRIM23 de Mus musculus para su expresión heteróloga en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

G proteins are a family of proteins that bind guanine nucleotides , these proteins are involved in various cellular processes including vesicular trafficking where ARF monomeric G proteins have a key role in the recruitment of coat proteins , formation and budding of vesicles . Thus the ARF proteins involved in vesicular trafficking between various cellular compartments such as the endoplasmic reticulum , the Golgi apparatus , endosomes . The protein contains several domains ARD1/TRIM23 including ARF is the domain which differs with ARF -like proteins in the presence of an alpha helix of 15 amino acids at the amino terminal portion, which participates in the interaction with the membrane in the formation of vesicles . The heterologous expression of recombinant proteins through expression plasmids provides one of the great advantages as a tool in molecular biology , because they can be used to determine the properties of proteins and to identify their function within the organisms studied . In this paper amplification and ARF domain fusion gene Mus musculus ARD1/TRIM23 with alpha helix protein of Saccharomyces cerevisiae ARF1 by PCR for subsequent cloning into the expression vector pYES2 described Saccharomyces cerevisiae / CT giving rise to plasmid recombinate ARF-MS-pYES2/CT . This plasmid was transformed to S. cerevisiae in which the heterologous expression was performed , obtaining the recombinant protein product and ARF- MS of 36 kDa . This fusion protein domain corresponds ARF gene ARD1/TRIM23 and ARF1 alpha helix formed by the plus a V5 epitope and six histidine residues at the carboxyl terminus peptide. The expression of the recombinant protein ARF- MS represents the first characterization oriented domain ARD1/TRIM23 ARF protein of step .

Las proteínas G son una familia de proteínas que unen nucleótidos de guanina, estas proteínas participan en varios procesos celulares entre ellos el tráfico vesicular donde las proteínas G monoméricas ARF tienen una función clave en el reclutamiento de proteínas de cubierta, formación y gemación de las vesículas. De esta manera las proteínas ARF participan en el tráfico vesicular entre varios compartimentos celulares, como son el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, endosomas. La proteína ARD1/TRIM23 contiene varios dominios entre los que se encuentra el dominio ARF, el cual difiere con las proteínas tipo ARF en la presencia de una alfa hélice de 15 aminoácidos en la parte amino terminal, la cual participa en la interacción con las membranas en la formación de las vesículas. La expresión heteróloga de proteínas recombinantes a través de plásmidos de expresión ofrece una de las ventajas más grandes como herramienta en la biología molecular, ya que puede ser utilizada para determinar las propiedades de las proteínas y para identificar su función dentro de los organismos estudiados. En el presente trabajo se describe la amplificación y fusión del dominio ARF del gen ARD1/TRIM23 de Mus musculus con la alfa hélice de la proteína ARF1 de Saccharomyces cerevisiae por medio de PCR para su posterior clonación en el vector de expresión de Saccharomyces cerevisiae pYES2/CT dando origen al plásmido recombinate ARF-MS-pYES2/CT. Con este plásmido se transformó a S. cerevisiae donde se realizó la expresión heteróloga, obteniendo como producto la proteína recombinante ARF-MS de 36 kDa. Esta proteína corresponde la fusión del dominio ARF del gen ARD1/TRIM23 y la alfa hélice de ARF1 más un péptido conformado por el epitope V5 y seis residuos de histidina en el extremo carboxilo.