Caracterización de mutantes del plásmido pUM505 sensibles a ciprofloxacina

Abstract

The pUM505 plasmid was isolated from a clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa, it has a length of 123 kilobases and contains 138 open reading frames (ORF). DNA sequence analysis revealed that pUM505 lacks antibiotic resistance genes reported to date; however, when the plasmid was transferred to the P. aeruginosa PAO1 strain conferred resistance to ciprofloxacin (Cp), an antibiotic of the quinolone family. To identify the genes responsible for Cp resistance a bank of mutants was generated by random transposition in P. aeruginosa strain PAO1SR (pUM505). From a total of 12,000 mutants analyzed, 12 ciprofloxacin sensitive mutants (CpS) were obtained and by sequencing was determined that 4 of the mutants were probably interrupted at the operon formed by the orf57, orf58 and orf59 genes, while another two mutants were interrupted at the orf87. Complementation of the mutant affected at orf57 with the wild gene orf57 led to recovery of the Cp resistance phenotype and confirmed the relationship with pUM505 phenotype. The aim of this study consists in identifying and characterize the interrupted mutant genes in the remaining mutant group.

El plásmido pUM505 fue aislado de una cepa clínica de Pseudomonas aeruginosa, posee un tamaño de 123 kilobases y cuenta con 138 marcos de lectura abiertos (ORF). Un análisis in silico reveló que el plásmido no posee genes de resistencia a antibióticos reportados hasta la fecha; sin embargo, al ser transferido a la cepa de P. aeruginosa PAO1 se encontró que pUM505 confiere resistencia a ciprofloxacina (Cp), un antibiótico de la familia de las quinolonas. Para identificar los determinantes responsables de la resistencia a Cp se generó un banco de mutantes por transposición al azar en la cepa P. aeruginosa PAO1SR (pUM505) y se seleccionaron mutantes sensibles a ciprofloxacina (CpS). De un total de 12,000 mutantes analizadas, se obtuvieron 12 mutantes CpS y mediante secuenciación se determinó que en 4 de las mutantes se encuentra interrumpido un probable operón formado por los orf57, orf58 y orf59, mientras que en otras 2 mutantes está interrumpido el orf87. La complementación de la mutante afectada en el orf57 con el gen silvestre condujo a la recuperación del fenotipo de resistencia a Cp y confirmó la relación del gen con el fenotipo de pUM505. Debido a que se cuenta con 6 mutantes CpS de las cuales se desconocen los genes relacionados con el fenotipo de susceptibilidad a Cp, el objetivo del presente trabajo consiste en identificar y caracterizar los genes interrumpidos en el grupo restante de mutantes.