Estandarización de PCR multiplex para la detección de los marcadores moleculares más comunes en la leucemia linfoblástica aguda pediátrica

Abstract

Genetic alterations in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL), affects the treatment and prognosis of the patient. The individual detection of fusion genes by conventional polymerase chain reaction (PCR) is impractical and laborious; thus, the implementation of a multiplex PCR would simplify molecular analysis. The objective of this study was to establish the conditions of multiplex PCR, in order to detect molecular markers of ALL. A panel of primers for fusion genes was included: AF4/MLL, BCR/ABL p190, BCR/ABL p210, ETV6/RUNX1 and TCF3/PBX1. Furthermore, the primers for the control gene ABL were added. Eighteen patients with acute leukemia were recruited within a period between 2018 and 2019 and RNA was extracted from peripheral blood samples at diagnosis, by the TriPure method. The cell lines RS4, SUPB15, K562 and REH, were used as positive controls in the standardization. Samples of healthy subjects and samples of patients with acute leukemia that don´t expressed fusion genes, were used as negative control. The standardized multiplex PCR reduced the necessary number of reactions for detecting molecular markers of ALL by 81 percent. Of the 12 patients diagnosed with ALL, 4 (33.3%) cases expressed some type of gene rearrangement; 2 (16.6%) were ETV6/RUNX1, 1 (8.3%) was BCR/ABL p210 b2a2, and 1 (8.3%) was AF4/MLL. In conclusion, the standardized conditions of multiplex PCR and multiplex nested PCR reduced the time and effort necessary for molecular evaluation, without affecting sensitivity and specificity of the method.

Las alteraciones genéticas en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda (LLA), influyen en el tratamiento y pronóstico del paciente. La detección de genes de fusión en forma individual por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional es poco práctica y laboriosa; por ello, la implementación de una técnica PCR multiplex simplificaría el análisis molecular. El objetivo del presente estudio fue establecer las condiciones de la técnica PCR multiplex, para detectar marcadores moleculares de LLA. Se incluyó un panel de oligonucleótidos para los genes de fusión AF4/MLL, BCR/ABL p190, BCR/ABL p210, ETV6/RUNX1 y TCF3/PBX1 y del gen control ABL. Se reclutaron 18 pacientes con leucemia aguda en el periodo de 2018 a 2019 y se extrajo RNA de muestras de sangre periférica al diagnóstico, por el método TriPure. Las líneas celulares RS4, SUPB15, K562 y REH, se utilizaron como controles positivos en la estandarización. Muestras de sujetos sanos y de pacientes con leucemia aguda que no expresaron genes de fusión, fueron utilizadas como control negativo. La técnica PCR multiplex estandarizada, redujo en un 81% la cantidad de reacciones necesarias para detectar marcadores moleculares de LLA. De los 12 pacientes diagnosticados con LLA, 4 casos (33.3%) presentaron algún gen de fusión; de los cuales 2 casos (16.6%) fueron ETV6/RUNX1, 1 caso (8.3%) BCR/ABL p210 b2a2 y 1 caso (8.3%) AF4/MLL. En conclusión, las condiciones estandarizadas de PCR multiplex y PCR anidado multiplex redujeron el tiempo y esfuerzo necesarios para la evaluación molecular, sin afectar la sensibilidad y especificidad del método.