Desarrollo y validación de un panel de pruebas moleculares para el diagnóstico por laboratorio de neoplasias mieloproliferativas clásicas

Abstract

Analysis of BCR -ABL1 transcripts by RT-PCR is routinely used to assess both diagnostic and treatment response in patients with chronic myeloid leukaemia (CML). Other Myeloproliferative Neoplasm (MPN) including polycythaemia vera (PV), essential thombocythaemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF) has been recently characterized at a molecular level showing the prevalence of a single point mutation in the cytoplasmic tyrosine kinase JAK2 (JAK2V617F), introducing a new excellent diagnostic molecular marker that been adopted by the World Health Organization (WHO) as a disgnostic criteria for these myeloid neplasms. These discoveries have changed the landscape for diagnosis and classification of chronic myeloproliferative disorders. The use of Taguchi method as an alternative approach to standardized a multiplex RT-PCR to detect both BCR-ABL1 and JAK2V617F markers in a simple test usefull in a routine molecular diagnostic practice. The development and standardization of the RT-PCR test to detect JAK2 V617F mutation and BCR -ABL1 translocation variants b2a2 and b3a2 was carried out using an orthogonal array including major factors affecting the PCR reaction (primer and Mg+2 concentration, Taq polymerase, annealing time and temperatures and PCR cycles) and their associated levels. Using this array through 36 independent assays we successfully optimized a simple test for both molecular markers. Additionally, the optimized test distinguishes homozygous from heterozygous mutations. The test was also design to analyze the presence of additional mutations on JAK2 exons 12 and 13 by sequencing analysis.

El análisis de los transcritos del gen de fusión BCR-ABL1 por RT-PCR es usualmente empleado para establecer el diagnóstico y la respuesta al tratamiento en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC). Otras neoplasias mieloproliferativos (NMP) incluyendo policitemia vera (PV), Trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis primaria (MFP) han sido recientemente caracterizadas a nivel molecular por la presencia de una mutación puntual en el gen JAK2 (JAK2V617F), el cual es adoptado como un excelente marcador molecular para el diagnóstico por la organización mundial de la salud (OMS) y forma parte de los criterios mayores de diagnóstico para estas neoplasias mieloides. El descubrimiento de JAK2V617F redefinido el diagnóstico y clasificación de las neoplasias mieloproliferativas crónicas. El uso de la metodología Taguchi es una atractiva alternativa en la estandarización de un RT-PCR Multiplex para la detección de los marcadores BCR-ABL1 y JAK2V617F en un ensayo único útil en el diagnóstico molecular de rutina. El desarrollo y la estandarización de la prueba RT-PCR Multiplex para detectar la mutación JAK2V617F y las variantes del gen de fusión BCR-ABL1 se realizó utilizando un arreglo ortogonal considerando las variables y los niveles de las mismas que influyen principalmente en un PCR (concentraciones de oligonucleótidos y Mg+2, Taq polimerasa, temperatura y tiempos de alineamiento, y ciclos de amplificación). Usando el arreglo ortogonal a través de 36 ensayos independientes se logró obtener exitosamente las condiciones óptimas para realizar en una prueba única la detección de ambos marcadores moleculares. Adicionalmente, la prueba optimizada es útil también para discernir entre la variante homocigota y heterocigota de la mutación JAK2V617F. La prueba también se diseñó para realizar la detección de mutaciones adicionales en el exón 12 y 13 del gen JAK2, por secuenciación de un producto de amplificación, que a la vez es control interno de la reacción de PCR.