Transformación genética de fresa con el gen de Snakina (PaSn) de aguacate nativo mexicano

Abstract

In the present investigation the strawberry was genetically transformed with the gene PaSn of native Mexican avocado (Persea americana Mill. var. drymifolia) via A. tumefaciens. The PaSn cDNA was isolated from the vector pTriplEx2-PaSn by PCR amplification. The amplified product was initially cloned in the vector pBluescript KS and subsequently in the vector PUCpSS to integrate the double CaMV35S promoter. The full expression cassette was released and incorporated into the vector pCAMBIA2301; the cDNA cloning PaSn gene was confirmed by sequencing. Strain pGV2260 of A. tumefaciens was transformed with the vector pCAMBIA-PaSn and was used to carry out the events of genetic transformation in strawberry (Fragaria x ananassa cv. Aromas). This transformation was realized by co-culture with root crown segments (0.5 cm) of strawberry plantlets. Explants were cultured to induce shoot proliferation in MS medium with 0.1 mg/L of naphtalenacetic acid and 0.5 mg/L of benzyladenine and for the development of seedlings in MS with 0.05 mg/L of benzyladenine added with 500 mg/L of cefatoxime and/or antibiotic selection (100 mg/L of kanamycin), in conditions in vitro at 25° C and 2000 lux at 16 h photoperiod until the development of kanamycin-resistant seedlings which were considered possible transformants. The transformation was verified by the presence of the gene PaSn by PCR and expression of the β-glucuronidase GUS assay. The results are indicative that the strawberry plants transformed with A. tumefaciens (pCAMBIA-PaSn) expressed genes nptII and uidA involved in the transformation. Also, it was confirmed that PaSn gene of native Mexican avocado, cloned in the binary vector pCAMBIA2301, was transferred into the genome of the transformed plants of strawberry.

En la presente investigación la fresa se transformó genéticamente con el gen PaSn de aguacate nativo mexicano (Persea americana Mill. var. drymifolia) vía A. tumefaciens. El cDNA del gen PaSn se aisló del vector pTriplEx2-PaSn por PCR. El producto amplificado fue clonado inicialmente en el vector pBluescript KS y posteriormente en el vector PUCpSS para integrar el doble promotor 35SCaMV. El cassette de expresión completo fue liberado e incorporado al vector pCAMBIA2301, la clonación del cDNA del gen PaSn fue confirmada por secuenciación. La cepa pGV2260 de A. tumefaciens se transformó con el vector pCAMBIA-PaSn y fue utilizada para realizar los eventos de transformación genética en fresa (Fragaria x ananassa cv. Aromas). Dicha transformación se realizó por co-cultivo con segmentos de corona de raíz (0.5 cm) de plántulas de fresa. Los explantes fueron cultivados en medio MS con 0.1 mg/L de ácido naftalenacético y 0.5 mg/L de benciladenina para la inducción de brotes y en medio MS con 0.05 mg/L de benciladenina para el desarrollo de plántulas adicionados con 500 mg/L de cefotaxima y/o el antibiótico de selección (100 mg/L de kanamicina) en condiciones in vitro a 25°C y 2000 lux a 16 h de fotoperiodo hasta lograr el desarrollo de plántulas resistentes a kanamicina las cuales fueron consideradas posibles transformantes. La transformación se verificó por la presencia del gen PaSn por PCR y la expresión de la ß-glucuronidasa con el ensayo de GUS. Los resultados indicaron que las plantas de fresa transformadas con A. tumefaciens (pCAMBIA-PaSn) expresaron los genes nptII y uidA involucrados en la transformación. Asimismo se confirmó que el gen PaSn de aguacate nativo mexicano, clonado en el vector binario pCAMBIA2301, fue trasferido al genoma de las plantas transformadas de fresa.