Aislamiento y análisis molecular de un gen de β-xilosidasa de Colletotrichum lindemuthianum

Abstract

Colletotrichum lindemuthianum is a hemibiotrophic fungus that secretes a cocktail of hydrolytic enzymes that participate in the degradation process of the plant cell wall (PCV). The hemicellulose of PCV requires for its complete degradation a complex mixture of hemicellulases, such as endoxylanases, β-xylosidases, endoglucanases, endomannanases, mannosidases α-arabinofuranosidases and galactosidases. In this work the bxyloA gene coding for a β-xilosidase of races 0 and 1472 of C. lidemuthianum was isolated, identified and analyzed. The bxyloA sequence consists of a structural region of 1860 bp with three introns and four exons. The transcript of bxyloA with a UTR5'of 199 bp has a reading frame of 1709 bp which codes for 570 residues with a stop codon and a UTR3' of 237 nt. In silico analysis of β-xylosidase (BXYLOA) showed a signal peptide cleavage site between S17I18 that generates a mature protein of 553 aa with five possible N-glycosylation sites at N132, 192, 258, 468,502. The 3D model of BXYLOA revealed the typical characteristics of the β-xilosidases GH43. The comparison with 26 sequences of putative β-xylosidases of genomes of Colletotrichum spp. showed a group with high percentages of similarity and identity (98-84 and 97-76%) and another group with low percentages (69-34 and 65-23%), indicating a high diversity. The residues of the BXYLOA catalytic site were located in D12D125E187, and are conserved in most of the β-xylosidases of Colletotrichum spp. The transcription profile by qPCR of bxyloA showed a significant increase of the transcript of the gene in the pathogenic race 1472 from the first minutes and towards 6 h, after induction with PCV of Phaseolus vulgaris.

Colletotrichum lindemuthianum es un hongo hemibiotrófico que secreta un coctel de enzimas hidrolíticas que participan en el proceso de degradación de la pared celular vegetal (PCV). La hemicelulosa de la PCV requiere para su degradación completa de una mezcla compleja de hemicelulasas, tales como endoxilanasas, β-xilosidasas, endoglucanasas, endomannanasas, manosidasas α-arabinofuranosidasas y galactosidasas. En este trabajo se aisló, identificó y analizó el gen bxyloA que codifica para una β-xilosidasa de las razas 0 y 1472 de C. lidemuthianum. La secuencia bxyloA consta de una región estructural de 1860 pb con tres intrones y cuatro exones. El transcrito de bxyloA con un UTR5´de 199 pb presenta un marco de lectura de 1709 pb que codifica para 570 residuos con un codón de detención y un UTR3´ de 237 nt. El análisis in silico de la β-xilosidasa (BXYLOA) mostró un sitio de corte del péptido señal entre S17I18 que genera una proteína madura de 553 aa con cinco posibles sitios de N-glicosilación en N132, 192, 258, 468,502. El modelo 3D de BXYLOA reveló las características típicas de las β-xilosidasas GH43. La comparación con 26 secuencias de β-xilosidasas putativas de genomas de Colletotrichum spp. mostró un grupo con altos porcentajes de similitud e identidad (98-84 y 97-76%) y otro grupo con bajos porcentajes (69-34 y 65-23%), indicando una alta diversidad. Los residuos del sitio catalítico de BXYLOA se localizaron en D12D125E187, y son conservados en la mayoría de las β-xilosidasas de Colletotrichum spp. El perfil de transcripción por qPCR de bxyloA mostró un importante incremento del transcrito del gen en la raza patógena 1472 desde los primeros minutos y hacia las 6 h, después de inducción con PCV de Phaseolus vulgaris.