Caracterización de la expresión específica en tejidos y órganos del gen AtSpen2 y de los genes que codifican enzimas sacarosafosfato sintasas (SPS), en Arabidopsis thaliana (L.), Heynh

Abstract

Spen proteins have at least one RNA binding (RRM) domain and a SPOC domain which is involved in protein-protein interactions; Spen proteins play a role in different biological processes. The Arabidopsis thaliana gene At4g12640 of unknown function, codes for a putative Spen-like protein. Using the yeast threehybrid system, it was determined that protein encoded by At4g12640 gene specifically interacts with 5’ RNA leader region of sps1 gene in rice, encoding an enzyme that allows the synthesis of sucrose. To understand the biological significance of this interaction, we analyzed At4g12640 gene (called AtSpen2 in this work) bioinformatically and its putative protein. In addition, we have characterized the tissue and organ specific activity of the AtSpen2 gene promoter. Furthermore, the activities of the upstream sequences of the four genes of A. thaliana encoding sucrose-phosphate synthase (SPS) enzymes were assessed in transgenic plants by using fusions to reporter genes. Bioinformatic analyses revealed that the SPOC domain of AtSpen2 protein exhibits low sequence identity to its equivalent domain in FPA (i.e., AtSpen1 protein) of A. thaliana; the low sequence identity between the two Spen proteins of Arabidopsis is even lower than that exhibited with Spen proteins from other plant species, such as rice OsRRM. Development and flowering time of AtSpen2 knock-out line (KO) as well in transgenic lines overexpressing AtSpen2 (OE) were analyzed, and surprisingly no significant phenotypic differences were observed respect to wild-type Col-0 line. We obtained A. thaliana plants transformed with a genetic construct that carries the promoter region of AtSpen2 fused to reporter genes uidA::gfp.

Las proteínas de tipo Spen tienen, al menos, un dominio que permite la unión a ARN (RRM) y otro dominio llamado SPOC, que participa en interacciones con otras proteínas, por lo que las proteínas Spen de plantas están involucradas en la regulación de diferentes procesos biológicos. El gen At4g12640 de Arabidopsis thaliana, codifica para una proteína putativa de tipo Spen de función desconocida. Mediante experimentos de interacción in vivo con el sistema de tres híbridos en levadura, se determinó que la proteína codificada por el gen At4g12640 interactúa de manera específica con la región 5’ líder (no traducida) del ARNm del gen sps1 de arroz, el cual codifica una enzima que sintetiza sacarosa. Para entender el significado biológico de esta interacción, se analizó bioinformáticamente el gen At4g12640 (denominado AtSpen2 en este trabajo) y su proteína putativa, además se caracterizó la actividad específica en tejidos y órganos del promotor de éste gen, así como las regiones reguladoras de los cuatro genes de A. thaliana que codifican enzimas sacarosa-fosfato sintasas (SPS). El análisis bioinformático reveló que el dominio SPOC de AtSpen2 presenta baja identidad en secuencia con el dominio equivalente de la segunda proteína Spen de A. thaliana, FPA, identidad que es incluso menor a la que exhibe respecto a proteínas Spen de otras especies, como OsRRM de arroz. Se analizó el crecimiento, desarrollo y tiempo de floración de líneas knock-out o de perdida de función (KO), y transgénicas (OE) que sobre-expresan el gen AtSpen2, pero en ambos casos no se encontraron diferencias significativas con respecto a la línea silvestre Col-0. Se obtuvieron plantas de A. thaliana transformadas con construcciones genéticas que llevan fusionada la región promotora del gen AtSpen2 a los genes reporteros uidA::gfp.