Actividad antifúngica y citotóxica de la defensina ϒ-tionina de chile habanero (Capsicum chinense) producida por células endoteliales bovinas

Abstract

Antimicrobial peptides (AP) are important components of the eukaryotic innate immune response. They have effects on the plasmatic membranes (PM) of bacteria, fungi and mammalian cells. Plant defensins (PD) are an AP group which have main activity against phytopathogenic fungi, although some PD have activity against Gram positive, Gram negative bacteria and tumoral cells. The increase in the selection of resistant microorganisms to conventional antibiotics and fungicides has propitiated the development of new antimicrobial or antifungal compounds. In this sense, PD represent a therapeutic alternative against mammalian pathogenic microorganisms, mainly from humans, for example Candida albicans. In this work, we generated a construction containing the cDNA of γ-thionin defensin from chile habanero (Capsicum chinense) cloned into the EcoRІ site from the mammalian expression vector pTracerC. This construction was used to transfect by lipofection the immortal bovine endothelial cell line BVE-E6E7 and was named pTCγ. The transfected cells were selected by fluorescence emission and zeocine resistance, and a polyclonal population with a stable integration (Co) was obtained. From this population, 9 clones were isolated (S1-S9) and 2 of them were selected, S1 and S2, in relation to their antifungal and cytotoxic activity. The expression of the mRNA for γ-thionin was confirmed in Co, S1 and S2 clones by RT-PCR and sequence analysis. The conditioned media (CM) from these clones were obtained, and their antifungal, antibacterial and cytotoxic activities were evaluated on the fungi C. albicans (ATCC 10231), the Gram positive bacterium Staphylococcus aureus (ATCC 27543), the Gram negative bacterium Klebsiella pneumoniae (ATCC 4352) and the tumoral cell lines MCF-7, A549 y HeLa. The endocytosis of C. albicans into the selected clones was also tested.

Los péptidos antimicrobianos (PA) son componentes importantes de la inmunidad innata de los eucariotes que actúan principalmente sobre las membranas plasmáticas (MP) de las bacterias, los hongos y las células de mamíferos. Las defensinas de plantas (DP) son un grupo de PA con un mecanismo de acción que favorece su actividad en contra de hongos fitopatógenos, aunque algunas DP poseen actividad contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y células tumorales. La selección de cepas de microorganismos resistentes a los antibióticos convencionales y el incremento en el número de individuos inmunocromprometidos, han motivado la búsqueda y el desarrollo de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana o antifúngica que presenten una baja toxicidad para el hospedero. En este sentido las DP representan una alternativa terapéutica contra microorganismos patógenos de mamíferos, particularmente los de humano como Candida albicans; sin embargo, existe poca investigación al respecto. En este trabajo se generó la construcción de integración al azar pTCγ que contiene el ADNc de la defensina γ-tionina de chile habanero (Capsicum chinense) clonado en el sitio EcoRІ del vector de expresión para mamíferos pTracerC. Esta construcción se utilizó para transfectar por lipofección la línea celular inmortal de endotelio bovino BVE- E6E7. Las células se seleccionaron por emisión de fluorescencia y resistencia a zeocina, y se obtuvo una población policlonal con integración estable (Co). A partir de esta se aislaron 9 clonas (S1-S9) y se seleccionaron dos: S1 y S2, con base en su actividad antifúngica y citotóxica. En estas clonas se confirmó la expresión del ARNm de la γ-tionina por RT-PCR y secuenciación del fragmento de ADNc amplificado.