Caracterización bioquímico-molecular de la enzima pectin liasa 2 (Clpnl2) de Colletotrichum lindemuthianum

Abstract

Here we report the isolation and sequence analysis of the Clpnl2 gene, which encodes the pectin lyase 2 (CLPNL2) in the phytopathogenic fungus C. lindemuthianum. The analysis was performed using the genomic sequence of Clpnl2 [GenBank: JN034038] and the Clpnl2 cDNA sequence obtained by RT-PCR amplification. The coding region of the Clpnl2 gene consisted of 1428 bp interrupted by four introns ranging in size from 60 to 87 bp. Several possible regulatory sequences were identified in the 5 ?and 3 ? untranslated regions of Clpnl2. The Clpnl2 cDNA contains an ORF of 1140 nucleotides that encodes a putative protein of 379 aa with a N-terminal secretion signal sequence of 19 aa. The molecular mass and pI calculated were 37.4 KDa and 9.1 respectively, and the one potential N-glycosylation site was located at position 110. The tertiary structure of Clpnl2 predicted by homology modeling coincided with the typical topology of the parallel ?-helix of pectin lyases (PNLs). A phylogenetic analysis of the deduced amino acids sequence of Clpnl2 and PNLs sequences reported in databases was performed. The analysis showed an early separation of pectin lyases into two groups, one represented by bacteria and another represented by fungi and oomycetes. The inferred tree also showed that the analyzed sequences of saprophytic/opportunistic fungi are clustered into a monophyletic group. However, phytopathogenic fungi and oomycetes were not clustered together. C. lindemuthianum clustered with the aa sequences of the fungal pathogen C. gloeosporioides. The tertiary structures corresponding to the aa sequences used in phylogenetic analyses were also predicted (including the carbohydrate-binding site) and compared their structures using three comparison methods. In agreement with the phylogenetic analyses, it was possible to distinguish the cluster formed mainly by sequences of fungi and oomycete pathogens, including Clpnl2 from the clusted formed by saprophytic/opportunistics fungi.

En este trabajo se reporta la caracterización del gen Clpnl2 que codifica la pectina liasa 2 (CLPNL2) del hongo patógeno de frijol Colletotrichum lindemuthianum. El análisis se realizó utilizando la secuencia genómica de Clpnl2 [GenBank: JN034038] y la secuencia del ADNc de Clpnl2 [GenBank: JN034039] obtenida mediante amplificación por RT-PCR. La región codificante del gen Clpnl2 consiste de 1,428 pb interrumpida por cuatro intrones con tamaños entre 60 a 87 pb. Se identificaron varias posibles secuencias regulatorias en las regiones no- codificantes 5 ́ y 3 ́ de Clpnl2. El ADNc de Clpnl2 contiene un ORF de 1,140 nucleótidos que codifican un supuesta proteína de 379 aa con una señal de secreción N-terminal de 19 aa, un tamaño molecular de 37.4 KDa, pI de 9.1, y un sitio potencial de N-glicosilación en posición 110. De acuerdo a la estructura tridimensional de CLPNL2 predicha por modelaje por homología, la estructura terciaria de CLPNL2 coincide con la topología típica de las pectin liasas (PNLs) en β-hélice paralela. Se realizó un análisis filogenético de la secuencia deducida de amino ácidos de CLPN2 y las secuencias reportadas de PNLs en las bases de datos. El análisis muestra la separación temprana de dos grupos: uno representado por PNLs bacterianas y otro compuesto por PNLs de hongos y oomicetos. Los árboles inferidos también muestran la formación de un grupo monofilético compuesto principalmente por secuencias de hongos saprófitos/oportunistas. Sin embargo, las secuencias de hongos y oomicetos fitopatógenos no forman un grupo monofilético. La PNL 2 de C. lindemuthianum se encontró agrupada con las secuencias de C. gloesporioides. Adicionalmente, se realizó el modelaje por homología de las secuencias utilizadas en el análisis filogenético y se compararon sus estructuras (incluyendo el sitio de unión a carbohidrato) utilizando tres métodos de comparación. Los resultados de éste análisis concuerdan con los obtenidos del análisis filogenético.