Caracterización bioinformática y experimental del sistema de lacasas en el género Trichoderma

Abstract

In this work, the laccase system from species of the fungal genus Trichoderma was analyzed. The bioinfomatic analysis in the genomes of reference strains showed that the common ancestor possessed two laccase genes, one coding for an enzyme with extracellular activity and the other, for intracellular activity. Bioinformatic and phylogenetic evidence show that species T. atroviride (IMI 2016040) and T. virens (Gv29-8) have differential patterns of conservation of those genes; that T. harzanium and T. reesei have lost the extracellular activity, and that T. asperellum (CBS 433.97) has acquired genes by horizontal transfer. Differences in the capacity to discolor colorants or oxidize phenolic compounds were observed in 23 wild Trichoderma spp. strains. Both, colorants and phenolic compounds are indicators of the extracellular laccase activity. T. viride showed the highest basal and induced with Sorghum stubble activities (763.88mU/mL and 2115.97mU/mL, respectively). T. atroviride did not shown basal activity but it was induced by Sorghum stubble. Extracellular laccase activity in T. harzianum and T. tomentosum is attributable to a ferroxidase-laccase and not to a laccase sensu-stricto. Specific primers for PCR amplification of extracellular laccase genes were designed. Amplification products and its sequences were obtained from wild T. atroviride, T. gamsii, T. viridescens, T. viride and T. koningii. Structural bioinformatic analysis showed that in silico translated proteins have a similar architecture to the Ascomycota crystallized laccases, with subtle conformational changes within the active site and the substrate cavity. This suggests intra and interspecies differences in the catalytic activity.

En el presente trabajo se analizó el sistema de lacasas en especies de hongos del género Trichoderma. El análisis bioinformático en los genomas de las cepas de referencia indica que el ancestro común del género Trichoderma poseía dos genes funcionales de lacasa, uno para la actividad extracelular y otro para la actividad intracelular. La evidencia bioinformática y filogenética muestra que las especies actuales presentan patrones diferenciales de retención de ambos genes (T. atroviride IMI 206040 y T. virens Gv29-8), pérdida de la actividad extracelular (T. harzianum y T. reesei) y adquisición adicional de genes mediante transferencia horizontal (T. asperellum CBS 433.97). En 23 aislados silvestres de Trichoderma spp. se encontraron diferencias en la capacidad para decolorar/oxidar medio de cultivo sólido suplementado con colorantes y compuestos fenólicos indicadores de la actividad de lacasa extracelular. La máxima actividad basal (763.88 mU/mL) e inducible con rastrojo de sorgo (2115.97 mU/mL) en cultivos líquidos fue producida por la cepa de T. viride. T. atroviride, no presenta actividad basal pero si inducible por rastrojo de sorgo. La actividad extracelular en T. harzianum y T. tomentosum es atribuible a una ferroxidasa-lacasa y no a una lacasa sensu stricto. Se diseñaron iniciadores específicos para la amplificación por PCR de los genes de lacasa extracelular en el género Trichoderma y se analizaron los productos de amplificación obtenidos para cepas silvestres de T. atroviride, T. gamsii, T. viridescens, T. viride y T. koningii. El análisis bioinformático estructural muestra proteínas con una arquitectura similar a las lacasas cristalizadas de hongos ascomicetos, con sutiles cambios conformacionales en el sitio activo y en la cavidad del sustrato, lo que sugiere un actividad catalítica diferencial intra e interespecífica.