Análisis funcional de homólogos bacterianos de la superfamilia CHR

Abstract

The Pseudomonas aeruginosa ChrA protein confers resistance to chromate by expelling chromate ions from the cytoplasm. The efflux of chromate is inhibited by sulfate, suggesting that ChrA binds sulfate. The role of eight basic residues of ChrA from P. aeruginosa has been analyzed previously, identifying some essential residues that probably bind chromate. However, ChrA has 28 total basic residues indicating that more basic residues may be essential for ChrA function. ChrA belongs to the CHR superfamily of transporters that currently comprises hundreds of homologs, including ChrA from Shewanella sp. ANA-3 and SrpC from Synechococcus elongatus, whose function on chromate resistance have not been reported. The CHR transporters have not been analyzed with respect to sulfate. The objective of this work was to analyze of the function of CHR transporters related to chromate and sulfate. The importance of the basic residues for the chromate resistance phenotype conferred by ChrA from P. aeruginosa was tested by site-directed mutagenesis. Residues R54 and R68 located in the large periplasmic P1 loop, and R340 in cytoplasmic loop C5, which are the most conserved, abolished chromate resistance when they were changed by alanine, suggesting that these residues interact directly with chromate. Sulfate transport through ChrA was evaluated using cell suspensions of P. aeruginosa PAO1 (pUCP20) (vector), and PAO1 (pUChrA), with chrA gene of pUM505. The levels of sulfate uptake were similar in both strains. The transport of sulfate was also analyzed in everted membrane vesicles from the P. aeruginosa strains.

El transportador ChrA confiere resistencia a cromato en Pseudomonas aeruginosa por medio de la expulsión del ion del citoplasma. La expulsión de cromato se inhibe por sulfato, lo que sugiere que ChrA interacciona con el sulfato. Se ha analizado previamente el papel de ocho aminoácidos básicos de ChrA de P. aeruginosa, y se identificaron algunos residuos esenciales que posiblemente interaccionan directamente con cromato, sin embargo, la proteína ChrA contiene 28 aminoácidos básicos totales lo que sugiere que más residuos básicos pueden ser esenciales para su función. ChrA pertenece a la superfamilia CHR constituida por cientos de homólogos, entre ellos ChrA de Shewanella sp. ANA-3 y SrpC de Synechococcus elongatus, cuya función no se ha descrito en relación con cromato. Ningún transportador CHR se ha analizado en relación con sulfato. El objetivo general de este trabajo fue caracterizar la función de los transportadores CHR en relación con cromato y sulfato. Se evaluó la importancia de algunos residuos básicos de ChrA de P. aeruginosa en la resistencia a cromato empleando mutagénesis dirigida. Mutaciones por alanina en los residuos R54, R68 localizados en el asa periplásmica P1 y R340, en el asa citoplásmica C5, causaron una disminución en el nivel de resistencia a cromato, lo cual sugiere que estos residuos probablemente interactúan con el cromato durante su expulsión del citoplasma. El transporte de sulfato se evaluó empleando suspensiones celulares de las cepas de P. aeruginosa PAO1 (pUCP20) (vector), y PAO1 (pUChrA) que contiene el gen chrA del plásmido pUM505. El nivel de captación de sulfato fue similar en ambas cepas. También se analizó el transporte de sulfato en vesículas invertidas de membrana empleando las mismas cepas.