Construcción y análisis funcional de una biblioteca metagenómica de rizosfera de plantas de trigo (Triticum aestivum L.)

Abstract

Only 1% or less of the total community of microorganisms living in soil can be cultured in lab conditions (Torsvik et al., 1990). Uncultured and molecular methods based on DNA analysis from soil samples have been developed to discover that unknown genomic material (Daniel, 2005). One of these is the construction and analysis of metagenomic libraries, which are a powerful tool that allows us to analyze genetic elements with potential novelty biotechnological applications. In this work, metagenomic DNA samples from rhizosphere of wheat plants were isolated to subsequently construct a metagenomic library in Escherichia coli, comprising at this moment of 1075 clones. 26 BACs were isolated and digested to be size analyzed, and it was found an average insert size of approximately 38 Kb. On the other hand, the BAC end sequences of 75 random clones were analyzed by Blastn search homology. These results show that genes involved in central metabolism are the most abundant with 33%. The sequences of the alpha and beta proteobacteria classes also were the most abundant within the library. Some interesting genes showed high identity with trehalose fosfate synthase, amidohydrolase, chromate resistance genes, just to name a few. In a functional search analysis also revealed two clones with beta-haemolytic activity and four clones with alpha haemolytic activity. Searching for antibiotic resistance activities, it was discovered that eight clones were resistant to tetracycline, seven to nalidixic acid and two clones with resistance to spectinomycin. Our results suggest that the hemolytic activity and the expression of antibiotic resistance genes could be defense mechanisms in a highly competitive environment such as the rhizosphere of plants. Finally, the construction of metagenomic libraries represents an excellent option to discover genes with biotechnological potential.

El número de microorganismos que son cultivables del suelo representa el 1% o menos del total de la comunidad microbiana (Torsvik et al., 1990). Métodos moleculares basados en el aislamiento y análisis de ADN de muestras de suelo se han desarrollado para acceder a todo este material genómico desconocido (Daniel, 2005). Uno de estos métodos es la construcción y análisis de bibliotecas metagenomicas, las cuales son una poderosa herramienta que nos permite analizar elementos genéticos con novedosas aplicaciones biotecnológicas. En este trabajo se tomaron muestras de ADN metagenómico de rizósfera de plantas de trigo. Posteriormente se construyó una biblioteca metagenómica en Escherichia coli de 1075 clonas. Se analizaron por digestión 26 BACs y se determinó un promedio del tamaño de los insertos de 38 Kb aproximadamente. Así mismo, se analizaron las secuencias de los extremos de algunos insertos tomados al azar. Los genes implicados en el metabolismo son los más abundantes con el 33%. Las secuencias de las clases alfa y beta proteobacteria son las más abundantes dentro de las 75 secuencias analizadas. Existen genes de interés biotecnológico como la trehalosafosfato sintasa, amidohidrolasa y genes de resistencia a cromato. Por otra parte, se realizó un análisis funcional a la biblioteca y se encontraron dos clonas con actividad beta hemolítica y cuatro con actividad alfa hemolítica. En el análisis de resistencia a antibióticos se descubrió que ocho clonas mostraron resistencia a tetraciclina, siete clonas resistencia a ácido nalidixico y dos clonas con resistencia a espectinomicina. Nuestros resultados sugieren que las actividades hemolíticas, así como la expresión de genes de resistencia a antibióticos, pueden ser mecanismos de defensa en un ambiente tan competido como lo es la rizósfera de plantas. Finalmente, la construcción de bibliotecas metagenomicas es una excelente opción para descubrir genes con potencial biotecnológico.