Determinación de la función del gen chrA de Neurospora crassa 74-A

Abstract

Bacterial ChrA transmembrane proteins expel the chromate ion from the cytoplasm towards the periplasm as a detoxification mechanism. ChrA proteins are part of the CHR transport superfamily, which is divided into the LCHR and SCHR families, which groups proteins with a size of around 400 and 200 amino acids respectively. The LCHR family includes hundreds of bacterial proteins, as well as fungi; Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Ustilago maydis and Gibberella zeae. However, the function of ChrA counterparts in fungi has not yet been reported. The objective of this work is to analyze the expression of the chrA gene in N. crassa as well as to study the function of the ChrA protein of N. crassa in a heterologous system (Saccharomyces cerevisiae). To analyze the expression of chrA, N. crassa was grown in potato dextrose broth with chromate, taking mycelium aliquots at intervals and a total RNA extraction was performed. Through RT-PCR it was determined that chrA gene expression is induced by this ion. To determine the ChrA function of N. crassa, the chrA gene from cDNA was subcloned into the binary vector pYES2 and the recombinant plasmid was transferred to S. cerevisiae. The transformants analyzed showed that ChrA confers hypersensitivity to chromate, contrary to what was expected due to the history of bacteria ChrA. This suggested that ChrA transports chromate in S. cerevisiae. Through mass spectrometry with inductive coupling plasma it was found that these hypersensitive transformants of S. cerevisiae accumulate more chromium in the biomass, supporting that the ChrA protein transports chromate.

Las proteínas transmembranales ChrA bacterianas expulsan el ión cromato del citoplasma hacia el periplasma como un mecanismo de destoxificación. Las proteínas ChrA forman parte de la superfamilia de transportadores CHR, la cual se divide en las familias LCHR y SCHR, que agrupa proteínas con un tamaño de alrededor de 400 y de 200 aminoácidos respectivamente. La familia LCHR incluye cientos de proteínas bacterianas, así como de los hongos; Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Ustilago maydis y Gibberella zeae. Sin embargo, la función de homólogos ChrA en hongos no ha sido reportada aún. El objetivo de este trabajo es analizar la expresión del gen chrA en N. crassa así como estudiar la función de la proteína ChrA de N. crassa en un sistema heterólogo (Saccharomyces cerevisiae). Para analizar la expresión de chrA, se creció N. crassa en caldo papa dextrosa con cromato, tomando alícuotas de micelio a intervalos y se realizó una extracción de RNA total. Mediante RT-PCR se determinó que la expresión del gen chrA se induce por este ión. Para determinar la función de ChrA de N. crassa, el gen chrA proveniente de cDNA se subclonó en el vector binario pYES2 y el plásmido recombinante se transfirió a S. cerevisiae. Las transformantes analizadas mostraron que ChrA confiere hipersensibilidad a cromato, contrario a lo que se esperaba debido a los antecedentes de ChrA de bacterias. Esto sugirió que ChrA transporta cromato en S. cerevisiae. Mediante espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo se encontró que estas transformantes hipersensibles de S. cerevisiae acumulan más cromo en la biomasa, apoyando que la proteína ChrA transporta cromato.