Análisis funcional de los genes que codifican al sistema toxina-antitoxina del plásmido pUM505

Abstract

The toxin-antitoxin (TA) systems are small genetic elements consisting of two genes encoding a toxin and an antitoxin. TA systems are distributed among bacteria and have been found in plasmids and chromosomes. They have been related to the stability of plasmids by post-segregational killing, because the toxin is more stable than the antitoxin, while it has been demonstrated the involvement of chromosomal TA systems in the virulence of the bacteria that have been found. The pUM505 plasmid, isolated from a clinical strain of Pseudomonas aeruginosa, has a pathogenicity island in which the orfs 123 and 124 encoding for a likely TA system are located. The orf 123 encodes a protein with 55% identity to the relE protein (toxic component) of TA system of Klebsiella pneumoniae. The orf 124 encodes a transcriptional regulator with an 82% identity to the HtH antitoxin protein of Pseudomonas alcaligenes. The objective of this work was to determine the role of the probable TA system of pUM505 plasmid. First, expression of orfs 123 and 124 was analyzed by RT-PCR using specific oligonucleotides of the overlapping region and found that both orfs are expressed forming an operon. By stability tests, it was observed that when the orfs 123 and 124 were cloned into the vector pJET, the recombinant plasmid pJET_orfs123-4 was maintained under nonselective conditions in Escherichia coli after six days of subculture, and pJET plasmid containing no insert was lost, indicating that the presence of orfs 123 and 124 increases plasmid stability. The orf 123 was cloned into an expression vector under control of the lac promoter and transferred to E. coli BL21.

Los sistemas Toxina-Antitoxina (TA) son elementos genéticos pequeños compuestos de dos genes que codifican a una toxina y una antitoxina. Los sistemas TA se encuentran distribuidos en las bacterias y han sido encontrados en plásmidos y cromosomas. Se han relacionado con la estabilidad de plásmidos mediante exterminio post-segregacional, debido a que la toxina es más estable que la antitoxina, mientras que se ha demostrado la participación de los sistemas TA cromosómicos en la virulencia de las baterías en las que han sido encontrados. El plásmido pUM505, aislado de una cepa clínica de Pseudomonas aeruginosa, posee una Isla de patogenicidad en la que se localizan los orfs 123 y 124 que codifican para un probable sistema TA. El orf 123 codifica a una proteína con un 55% identidad a la proteína RelE (componente tóxico) del sistema TA de Klebsiella pneumoniae. El orf 124 codifica a un probable regulador transcripcional con un 82% de identidad a la proteína antitoxina HTH de Pseudomonas alcaligenes. El objetivo de este trabajo fue determinar la función del probable sistema TA del plásmido pUM505. Primeramente se analizó la expresión de los orfs 123 y 124 mediante RT-PCR, utilizando oligos específicos de la región sobrepuesta y se comprobó que ambos orfs se expresan formando un operón. Mediante ensayos de estabilidad, se observó que cuando los orfs 123 y 124 fueron clonados en el vector pJET, el plásmido recombinante pJET_orfs123-4 se mantuvo bajo condiciones no selectivas en Escherichia coli después de seis días de subcultivos, mientras que pJET sin inserto se perdió, indicando que la presencia de los orfs 123 y 124 aumenta la estabilidad plasmídica. El orf 123 fue clonado en un vector de expresión bajo el control del promotor lac y transferido a E. coli BL21.