Determinación de la vía de señalización que activa a la proteína Arf2 de Mucor circinelloides durante el crecimiento levaduriforme

Abstract

The Arf family proteins belong to the superfamily of monomeric G proteins, while the ArfGEF proteins are the activators of the Arf proteins by carrying out the exchange of GDP for GTP, together their function is associated with the regulation of vesicular trafficking in the endocytic and secretory pathways. The rol of Arf and ArfGEF proteins has been described in various fungi such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Candida albicans, Magnaporthe oryzae and Fusarium oxysporum. Mucor circinelloides is a dimorphic fungus and opportunistic pathogen, being model to understand cell differentiation and virulence processes, where the function of six members belonging to the Arf family (Arf1-Arf4 and Arl1-Arl2) have been reported. Interestingly, of the 6 proteins reported to date in the contexts of dimorphism, antifungal susceptibility, mitochondrial homeostasis, and virulence, the Arf2 protein was the only one that showed a specialization for the promotion of yeast development. The objective of this work was to identify which ArfGEF protein is the activator of Arf2 during yeast development, as well as the signaling pathway that regulates this phenomenon. Through expression analysis of arfGEF genes in dimorphism, three genes (arfGEF2-4) that accumulated their transcript during yeast development were selected and using double hybrid assays, deletion and gene suppression, it was shown that the ArfGEF2 protein is the Arf2 activator. Using physiological, site-directed mutation and overexpression assays, it was shown that the signaling pathway that regulates the yeast development of M. circinelloides is the protein kinase A (PKA) pathway, through the proteins Cyr1, Pde2, PkaR1, ArfGEF2 and Arf2.

Las proteínas de la familia Arf pertenecen a la superfamilia de las proteínas G monoméricas, mientras que las proteínas ArfGEF son los activadores de las proteínas Arf al llevar el intercambio de GDP por GTP, en conjunto su función está asociada en la regulación del tráfico vesicular en las rutas endocítica y secretora. Se ha descrito la participación de proteínas Arf y ArfGEF en diversos hongos tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Candida albicans, Magnaporthe oryzae y Fusarium oxysporum. Mucor circinelloides es un hongo dimórfico y patógeno oportunista, siendo un modelo de estudio para entender procesos de diferenciación celular y virulencia, en donde se han reportado la función de seis miembros pertenecientes a la familia Arf (Arf1-Arf4 y Arl1-Arl2). Interesantemente, de las 6 proteínas reportadas a la fecha en contextos de dimorfismo, susceptibilidad a antifúngicos, homeostasis mitocondrial y virulencia, la proteína Arf2 fue la única que mostró una especialización para la promoción del desarrollo levaduriforme. El objetivo de este trabajo fue identificar que proteína ArfGEF es el activador de Arf2 durante el desarrollo levaduriforme, así como la vía de señalización que regula dicho fenómeno. Mediante análisis de expresión de los genes arfGEF en el dimorfismo, se seleccionaron tres genes (arfGEF2-4) que acumularon su transcrito durante el desarrollo levaduriforme y usando ensayos de doble hibrido en levadura, deleción y supresión génica se demostró que la proteína ArfGEF2 es el activador de Arf2. Usando ensayos fisiológicos, de mutación sitio dirigida y sobreexpresión, se demostró que la vía de señalización que regula el desarrollo levaduriforme de M. circinelloides es la vía de la proteína cinasa A (PKA), a través de las proteínas Cyr1, Pde2, PkaR1, ArfGEF2 y Arf2.