Análisis de la función del gen ywrC de Bacillus subtilis

Abstract

The mechanism of resistance is the best studied chromate conferred by membrane transporter CHRA belonging to the superfamily CHR. This superfamily comprises two families: LCHR large proteins with a size of ~ 400 amino acids (aa) and small proteins SCHR a size of ~ 200 aa. The Bacillus subtilis genome encodes a 168 SCHR protein pair (Chr3N and Chr3C) conferring resistance to chromate couple when expressed in Escherichia coli. Upstream of the gene encoding the protein Chr3N, is the ywrC gene has homology with the family of regulatory proteins LRP. Therefore, it is proposed that ywrC regulator is the expression of genes chr3C chr3N and forming an operon. The aim of this work is to test the functionality of the gene of B. subtilis ywrC 168. By susceptibility tests, it was found that chr3N- and chr3C- of B. subtilis mutants are more sensitive to chromate wild strain, while the ywrC- mutant showed a chromate resistance phenotype. These results suggest that the ywrC gene, termed in this paper CHRS, functions as a negative regulator by eliminating, enables increased expression of the genes chr3N and chr3C. The group-CHRS-chr3N chr3C genes cloned into the expression vector plasmid pACYC184 and the recombinant was transferred to E. coli. By susceptibility testing it was found that in E. coli transformants chromate resistance decreased with the presence of CHRS, confirming the results obtained with B. subtilis mutants that this gene acts as a negative regulator. Furthermore, the expression pattern of genes chr3C chr3N and to be present RHC gene by RT-PCR assays analyzed.

El mecanismo de resistencia a cromato mejor estudiado es el conferido por el transportador de membrana ChrA que pertenece a la superfamilia CHR. Esta superfamilia comprende dos familias: proteínas grandes LCHR con un tamaño de ~400 aminoácidos (aa) y proteínas pequeñas SCHR de un tamaño de ~200 aa. El genoma de Bacillus subtilis 168 codifica un par de proteínas SCHR (Chr3N y Chr3C) que confieren resistencia a cromato cuando se expresan en pareja en Escherichia coli. Río arriba del gen que codifica a la proteína Chr3N, se encuentra el gen ywrC que tiene homología con la familia de proteínas reguladoras Lrp. Por lo anterior, se propone que ywrC es el regulador de la expresión de los genes chr3N y chr3C, formando un operón. El objetivo de este trabajo es probar la funcionalidad del gen ywrC de B. subtilis 168. Mediante pruebas de susceptibilidad, se encontró que las mutantes chr3N- y chr3C- de B. subtilis son más sensibles a cromato que la cepa silvestre, mientras que la mutante ywrC- presentó un fenotipo de resistencia a cromato. Estos resultados sugieren que el gen ywrC, denominado en este trabajo chrS, funciona como un regulador negativo que, al eliminarse, permite una mayor expresión de los genes chr3N y chr3C. El grupo de genes chrS-chr3N-chr3C se clonó en el vector de expresión pACYC184 y el plásmido recombinante se transfirió a E. coli. Mediante pruebas de susceptibilidad se encontró que en las transformantes de E. coli la resistencia a cromato disminuyó con la presencia de chrS, lo que confirmó el resultado obtenido con las mutantes de B. subtilis de que este gen actúa como un regulador negativo. Por otra parte, se analizó el patrón de expresión de los genes chr3N y chr3C al estar presente el gen chrS, mediante ensayos de RT-PCR.