Desarrollo de una prueba molecular para la identificación de mutaciones asociadas a resistencia al tratamiento de pacientes con leucemia mieloide crónica

Abstract

Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal hematological disorder characterized by the presence of the fusion protein BCR-ABL1 which occurs as result of the translocation between chromosome 9 and 22. BCR-ABL1 has tyrosine kinase activity constitutively activated, which activates multiple cellular signaling pathways that promote abnormal cell proliferation, differentiation, apoptosis inhibition, decreased adhesion to stroma and increased motility. The treatment of choice for patients thus diagnosed includes tyrosine kinase inhibitor Imatinib mesylate (Gleevec®). The efficacy of imatinib in the treatment of CML is remarkable, but the development of certain forms of resistance and persistence of minimal residual disease have decreased the initial excitement caused. The most common resistance mechanism is the presence of mutations in the kinase domain of ABL1. Have been reported at least 73 different mutations, which lead to the replacement of 50 amino acids, which occur at different frequencies and conferred different levels of resistance to Imatinib. T315I mutation was first mutation identified in patients resistant, which is located at a position that regulates the binding inhibitors tyrosine kinase activity, by suggesting a poor clinical outcome and timely identification is extremely important to avoid inadequate treatments that allow the progression of the disease. In this paper we present a strategy based on AS- PCR technique for detection of the T315I mutation and optimization by Taguchi methodology. L4 orthogonal array by analyzing three variables of the PCR reaction for the detection of mutation T315I (Tm, time alignment, and number of cycles) to 2 levels, determining the percentage contribution of each factor.

La Leucemia Mieloide Crónica (CML) es un desorden hematológico clonal caracterizado por la presencia de la proteína de fusión BCR-ABL1, resultado de la translocación entre el cromosoma 9 y 22. BCR-ABL1 es una proteína tirosina cinasa constitutivamente activa, la cual induce múltiples vías de señalización celular que promueven una anormal proliferación celular, diferenciación, inhibición de la apoptosis, disminución en la adhesión al estroma e incrementada motilidad. El tratamiento de elección para los pacientes así diagnosticados incluye al inhibidor de tirosina cinasas Imatinib Mesylate (Gleevec®). La eficacia de Imatinib en el tratamiento de la CML es remarcable, pero el desarrollo de ciertas formas de resistencia y la persistencia de enfermedad mínima residual han disminuido el entusiasmo inicial que provocó. El más frecuente mecanismo de resistencia identificado es la presencia de mutaciones puntuales en el dominio cinasa de ABL1. Se han reportado al menos 73 mutaciones puntuales diferentes, que conducen a la sustitución de 50 aminoácidos, las cuales ocurren con diferentes frecuencias y confieren diferentes niveles de resistencia a Imatinib. La mutación T315I fue la primer mutación identificada en pacientes resistentes, esta se sitúa en una posición que regula la unión a inhibidores de la actividad tirosina cinasa, por lo que sugiere un peor pronóstico clínico y su identificación oportuna es de gran importancia para evitar los tratamientos inadecuados que permitan la progresión de la enfermedad. En este trabajo se presenta una estrategia basada en la técnica de AS-PCR para la detección de la mutación T315I y su optimización a través de la metodología Taguchi. Mediante un arreglo ortogonal L4 analizando 3 variables de la reacción de PCR para la detección de la mutación T315I (Tm, tiempo de alineamiento y número de ciclos) a 2 niveles, determinando el porcentaje de contribución de cada factor.