Vectores de expresión de genes que codifican para proteínas fluorescentes para Mucor circinellodes

Abstract

Fluorescent proteins are special polypeptides; they have a chromophore group in their structure. This group has the ability to produce fluorescence in specific conditions; when the protein is excited at certain wavelength in presence of molecular oxygen (O2) an oxidation reaction occurs that renders the chromophore formation. In the middle of the protein there are three amino acids, they are the responsible of the activation of the chromophore. Those residues are 65 – 67 in the Green Fluorescent Protein-GFP (Ser65-Tyr66-Gly67). The GFP protein has been used as a great marker since it was cloned in 1992. GFP gene has been expressed in different organisms, from bacteria followed by yeast, mammals, plants and filamentous fungi. Flourescent Proteins are one of the greatest molecular tools that are used as molecular markers to understand life process. Mucor circinelloides is a dimorphic fungus belonging to the Zygomicete class; there is not a fluorescent protein tool to be used in this fungal organism. In this work, we have made different expression plasmids with fluorescent protein genes. All the plasmids were transformed into M. circinelloides R7B strain. We evaluated the fluorescence of these FP’s in R7B strain. However, our results showed a high level of autofluorescence in this fungus on green, red and blue colors of the visible spectrum, the blue was the highest autofluorescence. The transformed strains showed the same fluorescent respect to the control strain plasmidless, indicating not enough fluorescent protein expression to overcome the autofluorescence of M. circinelloides.

Las proteínas fluorescentes son cadenas de aminoácidos con una característica muy especial, contienen grupos que al recibir cierta longitud de onda permiten la emisión de un espectro de luz diferente al recibido (fluorocrómos) es decir producen fluorescencia. La formación del fluorocrómo se lleva a cabo en presencia de O2 molecular por una oxidación en la región central de la proteína, donde se encuentra una secuencia de aminoácidos específica que en la proteína verde fluorescente (GFP) es, Ser65-Tyr66-Gly67, produciendo fluorescencia que se observa como luz verde. Debido a que el fluorocrómo de la GFP se forma espontáneamente está puede ser usada como marcador a prácticamente cualquier proteína. Las PFs son grandes herramientas utilizadas como marcadores moleculares para el monitoreo de procesos in vivo, estas proteínas han sido utilizadas en diferentes tipos de organismos, mamíferos, plantas y algunos hongos. Mucor circinelloides es un zigomiceto dimórfico, para el cual no existe una herramienta molecular que permita la observación de procesos in vivo. En el equipo de trabajo se realizaron diferentes construcciones que contienen genes que codifican para distintas proteínas fluorescentes. Las cuales se encuentran en cepas transformadas de M. circinelloides (R7B). Por lo cual fue de nuestro interés evaluar la posible fluorescencia de diversas PFs en la cepa de Mucor circinelloides R7B. Nuestros resultados mostraron una autofluoresencia muy fuerte en la cepa R7B, en los espectros verde, rojo y azul siendo esté último el que presenta la mayor intensidad. Se desconoce las moléculas implicadas en dicha autofluorescencia. En las cepas transformadas con los plásmidos que expresan las PFs, la fluorescencia fue la misma que en la emitida por la misma cepa control, por lo que no se observó una expresión de las proteínas fluorescentes.