Caracterizaciín de proteína(s) cinasas en la vía de señalizaciín PDK/TOR/S6K en Arabidopsis thaliana

Abstract

The Toll-like protein of rapamycin (TOR) signalling pathway plays a key role in the plant stress response by regulating the cell cycle to maintain a balance between cell proliferation and differentiation. In mammals, one of the major targets of the mammalian TOR complex (mTOR) is the Akt protein, which regulates a variety of cellular processes including cell growth and differentiation. However, several components of the mTOR pathway are conserved in plants, such as 3 - phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1), a conserved master regulator of the AGC kinase (protein kinase A, G and C (PKA, PKC, PKG)) families in eukaryotic organisms, which could directly activate the TOR complex, but TOR activation by PDK1 in plants is not fully understood. In this project, the involvement of some elements of the TOR signalling pathway in plants was investigated. The first approach was to search for proteins that could perform the function of the Akt protein, since there is no Akt ortholog in the Arabidopsis genome. Immunoprecipitations were performed with monoclonal antibodies against Akt, using protein extracts from wildtype Columbia-0 (Col-0) plants. Sequencing of the proteins obtained from these immunoprecipitations revealed cell cycle elements; interestingly, among the elements found was the WEE1 kinase, a master regulator of the DNA damage repair system in meristems, so as a second approach the involvement of this kinase in the TOR signalling pathway in A. thaliana was studied. The inhibitor BX517, a mammalian PDK1 inhibitor, was used for this evaluation.

La vía de señalización de la proteína diana de la rapamicina (TOR, por sus siglas en inglés) desempeña un papel fundamental en la respuesta de las plantas al estrés, ya que regula el ciclo celular para mantener un equilibrio entre la proliferación y la diferenciación celular. En mamíferos uno de los principales blancos del complejo TOR de mamíferos (mTOR) es la proteína Akt, la cual regula diversos procesos celulares entre los que se encuentra el crecimiento y diferenciación celular. En plantas no se ha reportado una proteína Akt, sin embargo, varios componentes de la vía de señalización de mTOR se conservan en plantas, como es el caso de la proteína cinasa dependiente de 3-fosfoinosítidos 1 (PDK1), un regulador maestro conservado de las cinasas AGC (familias de proteína cinasa A, G y C (PKA, PKC, PKG) en organismos eucariotas. La activación de TOR por PDK1 en plantas no se comprende por completo. En este proyecto, se estudió la participación de algunos elementos de la vía de señalización de TOR en plantas. Como primer enfoque se realizó una búsqueda de proteínas que pudieran cumplir la función de la proteína Akt ya que en el genoma de Arabidopsis thaliana no está presente un ortólogo de Akt. Se realizaron inmunoprecipitaciones con anticuerpos monoclonales originados contra Akt, utilizando extractos de proteínas de plantas silvestres del ecotipo Columbia-0 (Col-0). La secuenciación de las proteínas obtenidas de esas inmunoprecipitaciones indicó elementos propios del ciclo celular, interesantemente entre los elementos encontrados está presente la cinasa WEE1 un regulador maestro del sistema de rescate de daños en el ADN en los meristemos, por lo tanto, como segundo enfoque se estudió la participación de dicha cinasa en la vía de señalización de TOR en A thaliana. Para llevar a cabo esta evaluación se utilizó el inhibidor BX517, un inhibidor de PDK1 de mamíferos.