Aislamiento y caracterización molecular de un gen de Endo-β-(1,6)-D-galactanasa de Colletotrichum lindemuthianum

Abstract

As part of the lytic system plant cell wall degradation employing the fungus Colletotrichum lindemuthianum in their interaction with beans, the -galactanasa enzyme is endo-β- (1-6) involved in the degradation of arabinogalactan (AG). The AG are polysaccharides composed of a main skeleton of D-galactose linked by β- (1-3), substituted at C (O) 6 side chains of β- (1-6) -D-galactose and generally completed in L-arabinose. The AG are located in the soluble fraction of the hemicellulose and pectin or found linked via hydroxyproline proteins forming so called protein arabinogalactan (AGPs), a family of complex proteoglycan found in the cell wall, cell membrane and the extracellular matrix. The function reported for the endo-β- (1-6) -D-linked galactanase is degrading β- (1-6) -D-galactose and galactosídicos releasing endo-β- (1-6) -galactobiosa. A fragment of 1101 bp was identified corresponding to a transcript with an open reading frame of 367 amino acids deduced with a stop codon, one at the 3'end UTR of 118 bp and a poly (A) of 33 adenines was termed the Clebg . Comparison with databases showed 80-85% similarity with the amino acid sequences of β- (1,6) -D-galactanases reported for Glomerella graminicola Colletotrichum gloesporoides and Colletotrichum higginsianum. The in silico analysis based on the Man5A showed stable crystallized protein interactions. Expression of the gene of endo-β- (1,6) -D-galactanase grown Colletotrichum lindemuthianum by qPCR xylan, arabinogalactan (LWAG) and cell wall by 0, 2, 6, 12, 24 and 48 hours was evaluated . The gene of the endo-β- (1,6) -D-galactanase Colletotrichum lindemuthianum presents baseline expression in the presence of glucose and is induced in pathogen race (1472) in culture with plant cell wall but not on race non-pathogenic (0) and this substrate the best inducer of gene expression of endo-β- (1,6) -D-galactanase.

Como parte del sistema lítico de degradación de pared celular vegetal que emplea el hongo Colletotrichum lindemuthianum en su interacción con frijol, se encuentra la enzima endo-β-(1-6)-galactanasa involucrada en la degradación de arabinogalactanos (AG). Los AG son polisacáridos compuestos por un esqueleto principal de D-galactosa unidos por enlaces β-(1-3), sustituidos en C(O)6 por cadenas laterales de β-(1-6)-D-galactosa y terminados generalmente en L-arabinosa. Los AG se localizan en la fracción soluble de la hemicelulosa y pectina o se pueden encontrar unidos vía hidroxiprolina a proteínas formando las denominadas proteínas de arabinogalactano (AGPs), una familia de proteoglucanos complejos que se encuentran en la pared celulares, membrana plasmática y en la matriz extracelular. La función reportada para la endo-β-(1-6)-D-galactanasa es degradar enlaces β-(1-6)-D-galactosídicos liberando galactosa y endo-β-(1-6)-galactobiosa. Se identificó un fragmento de 1101 pb correspondiente a un transcrito con un marco de lectura de 367 aminoácidos deducidos con un codón de detención, un UTR en el extremo 3´ de 118 pb y un poli(A) de 33 adeninas al que se denominó Clebg. La comparación con bases de datos mostró 80-85% de similitud con las secuencias de aminoácidos de β-(1,6)-D-galactanasas reportadas para Glomerella graminícola, Colletotrichum gloesporoides y Colletotrichum higginsianum. El análisis in silico basado en la proteína Man5A cristalizada no mostró interacciones estables. Se evaluó la expresión del gen de la endo-β-(1,6)-D-galactanasa de Colletotrichum lindemuthianum por qPCR crecido de xilana, arabinogalactano (LWAG) y pared celular por 0, 2, 6, 12, 24 y 48 horas. El gen de la endo-β-(1,6)-D-galactanasa de Colletotrichum lindemuthianum presenta niveles basales de expresión en presencia de glucosa y se induce en la raza patógena (1472) en cultivo con pared celular vegetal pero no en la raza no patógena (0) siendo este sustrato el mejor inductor de la expresión del gen de la endo-β-(1,6)-D-galactanasa.