Estudio del papel de proteínas homologas a ChrA de pUM505 de Pseudomonas aeruginosa en la virulencia

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous Gram-negative bacteria and an opportunist pathogen that produces many virulence factors. The conjugative plasmid pUM505 (123 kb), isolated from a clinical strain of P. aeruginosa, confers resistance to chromate ions through the chrBAC operon, with the ChrA protein being responsible for this resistance. In addition, the transfer of ChrA has been shown to increase the virulence of P. aeruginosa. ChrA belongs to the CHR protein superfamily, which is classified into small CHR proteins (SCHR;~200 aa) and large CHR proteins (LCHR; ~400aa). The ChrA protein encoded by pUM505 belongs to the LCHR family and shares homology with the ChrA2 protein of Burkholderia xenovorans LB400 and the Chr3NC protein pair of Bacillus subtilis 168, which belong to the LCHR and SCHR families, respectively. The objective of this study was to determinate the role of the homologous proteins ChrA2 and Chr3NC in bacterial virulence. Heterologous expression of the chrA2 and chrk3NC in P. aeruginosa increased both the virulence of P. aeruginosa PAO1 and the toxicity of culture supernatants, suggesting the secretion of a virulence associated molecule. Furthermore, expression of the chr genes increased bacterial oxygen consumption as well as hydrogen peroxide production. Changes in sulfate or phosphate concentrations in the culture medium altered the toxicity of supernatants, whereas the use of subinhibitory concentration of potassium cyanide (which dissipates the membrane potential) and N-acetylcysteine (a molecule that neutralizes Reactive Oxygen Species, ROS) reduce virulence. In addition, the addition of subinhibitory concentrations of chromate (an inducer of oxidative stress) to the culture medium increased both the toxicity of the supernatants and the mRNA levels of the chr genes, suggesting that chromate acts as an inducer.

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa ubicua y patógeno oportunista que produce muchos factores de virulencia. El plásmido conjugativo pUM505 (123 kb), aislado de una cepa clínica de P. aeruginosa, confiere resistencia al ion cromato mediante el operón chrBAC, siendo la proteína ChrA la que confiere resistencia. Además, al ser transferida ChrA incrementa la virulencia de P. aeruginosa. La proteína ChrA pertenece a la superfamilia de proteínas CHR que se clasifica en proteínas pequeñas o SCHR (~200 aa) y grandes o LCHR (~400 aa). La proteína Chra del pUM505 forma parte de la familia LCHR y cual comparte homología con la proteína ChrA2 de Burkholderia xenovorans LB400 y el par de proteínas Chr3NC de Bacillus subtilis 168, que corresponde a la familia de proteínas LCHR y SCHR, respectivamente. El objetivo del presente trabajo fue determinar el papel de las proteínas ChrA2 y Chr3NC homologas en la virulencia de las bacterias. En este trabajo se determinó que la expresión heteróloga en P. aeruginosa de los genes chrA2 y chr3NC incrementaron la virulencia de P. aeruginosa PAO1 y la toxicidad de los sobrenadantes del cultivo, sugiriendo la secreción de una molécula de virulencia. Además, la expresión de los genes chr aumentó tanto el consumo de oxígeno de las bacterias como la producción de peróxido de hidrógeno. Cambios en la concentración de sulfato o fosfato en el medio de cultivo modificaron la toxicidad de los sobrenadantes; mientras que el uso de concentraciones subinhibitorias de cianuro de potasio (que abate el potencial de membrana), así como de N-acetilcisteína (molécula que neutraliza las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO)) disminuyeron la virulencia. Además, la adición de concentraciones subinhibitorias de cromato (inductor de estrés oxidativo) al medio de cultivo aumentó la toxicidad de los sobrenadantes y los niveles de RNAm de los genes chr, sugiriendo que el cromato actúa como un inductor.