Análisis molecular del plásmido pBMBt1 de Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14-4 que se replica por el mecanismo del círculo rodante

Abstract

Bacillus thuringiensis is a Gram positive bacterium widely studied because Cry proteins are used as bioinsecticides. B. thuringiensis strains contain a complex pattern of plasmids (1-17) which vary in size from 2 to 200 kilobases (kb). The genes encoding the insecticidal proteins are located on large conjugative plasmids. Most of the small plasmids (< 15 kb) studied in B. thuringiensis replicate by the rolling circle mechanism (RC plasmids) in which single stranded DNA intermediates (ssDNA) are produced. The functions of these RC plasmids in B. thuringiensis are unknown; additionally the number of cloning vectors for gene transfer in B. thuringiensis is limited. The objective of this work was to characterize the genetic elements of plasmid pBMBt1 from B. thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14 -4. Southern blot and S1 nuclease digestion analysis show that pBMBt1 contains ssDNA intermediates. Subsequently, pBMBt1 was completely sequenced and the analysis of sequence showed that pBMBt1 is a circular molecule of 6700 bases of pairs (bp) with a GC content of 32%, furthermore three open reading frames (ORFs) were identified. The predicted protein of ORF1 (Cry14-4) showed the highest identity with the CryC53 protein from B. thuringiensis subsp. cameroun (24.6%); Cry15Aa from B. thuringiensis subsp. thompsoni (21.9%) and Mtx2/3 from B. sphaericus (27.8%). This is the first report that shows the presence of a cry-like gene (cry14-4) in a RC plasmid from B. thuringiensis. The ORF2 (Mob14-4) encodes a Mob protein which is involved in the conjugative mobilization of small plasmids. The Mob14-4 protein showed 74% identity with a Mob protein encoded by plasmid pUIBI-1 from B. thuringiensis subsp. entomocidus and 64% identity with a Mob protein from pBMY1 plasmid from Bacillus mycoides. The mob14-4 gene is functional, as shown by determination of transfer frequencies of 9.1 x 10-6 transconjugants/recipient cell of plasmid pHTmob14-4, which contain the mob14-4 gene from pBMBt1.

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva ampliamente estudiada debido al uso de sus proteínas Cry como bioinsecticidas. Las cepas de B. thuringiensis se caracterizan por contener un numero variable de plásmidos (1-17) cuyos tamaños varían de 2 hasta 200 kilobases (kb). Los genes que codifican estas proteínas insecticidas se encuentran en plásmidos grandes y conjugativos. La mayoría de los plásmidos pequeños (< 15 kb) estudiados de B. thuringiensis se replican por el mecanismo del circulo rodante (plásmidos RC), caracterizado por producir intermediarios de ADN de cadena sencilla (ADNcs). La función que desempeñan estos plásmidos RC en B. thuringiensis se desconoce; adicionalmente, el nu?mero de vectores de clonación para la transferencia de genes a B. thuringiensis es limitado. Debido a esto, el objetivo del presente trabajo fue la caracterización de los elementos genéticos del plásmido pBMBt1 de B. thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14-4. Mediante hibridaciones tipo Southern y digestio?n con nucleasa S1 se detectaron intermediarios de ADNcs provenientes del plásmido pBMBt1, característica distintiva de los plásmidos RC. Posteriormente se obtuvo la secuencia de nucleótidos de pBMBt1. El análisis revelo? que pBMBt1 es una molécula circular de 6,700 pares de bases (pb) con un contenido de GC del 32% y se identificaron tres marcos de lectura abiertos (ORFs). La proteína del ORF1 (Cry14-4) mostro? identidad con las proteínas CryC53 de B. thuringiensis subsp. cameroun (24.6%); Cry15Aa de B. thuringiensis subsp. thompsoni (21.9%) y Mtx2/3 de B. sphaericus (27.8%). Este es el primer reporte de la presencia de un gen que codifica una protei?na con identidad a proteínas Cry y que se encuentra en un pla?smido RC de B. thuringiensis. El ORF2 (Mob14-4) codifica la protei?na Mob involucrada en la movilización conjugativa de pla?smidos pequen?os.