Caracterización de una cepa silvestre de Didymosphaeria sp. (sin.= Paraconiothyrium brasiliense sensu lato) y aplicaciones derivadas de su actividad ligninolítica

Abstract

In this work, strain CMU-­196 isolated in the state of Michoacán was characterized; identified at first as Paraconiothyrium brasiliense through molecular phylogeny using the ITS1 region of rDNA2, but later assigned to Didymosphaeria sp. Strain CMU-­196 was able to metabolize 57 out of 95 substrates of Biolog plates, including dextrins and glycogen, as well as α-­D-­lactose, an inducer of cellulolytic enzymes poorly assimilated by fungi. It was also able to antagonize and inhibit in vitro growth of phytopathogenic fungi and oomycetes of Colletotrichum and Phytophthora genera, respectively, as well as to decolorize phenolic dyes and wastewater from paper industry. Extracellular activity of ligninolytic enzymes laccase (LAC), manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) was detected in strain CMU-­196. However, genomic and proteomic evidence generated by other research groups during the development of this work revealed that ascomycetes do not have genes coding for MnP and LiP. Corn straw significantly increases extracellular LAC activity of CMU-­196 strain related to basal potato medium broth and solid state fermentation assays showed that studied strain considerably delignificates this biomass, improving its in vitro ruminal digestibility. Purified extracellular LAC of studied strain showed a 98 kDa3 molecular mass and optimal catalytic conditions at pH 4.5 and 60°C, with high affinity for ABTS4 and dimethoxyphenol (DMP). The in silico obtained amino acid sequence of extracellular LAC of the strain CMU-­196 presents the domains and motifs of a laccase sensu stricto of ascomycetes, and the phylogenetic analysis shows a close relationship with the enzymes of Paraconiothyium sporulosum and phytopathogenic ascomycete Fusarium oxysporum.

En este trabajo se caracterizó a la cepa CMU-­196 aislada en el estado de Michoacán, inicialmente identificada como Paraconiothyrium brasiliense mediante filogenia molecular empleando la región ITS de rDNA, pero posteriormente asignada a Didymosphaeria sp. La cepa CMU-­196 fue capaz de metabolizar 57 de 95 sustratos de las placas Biolog, incluidas dextrinas y glicógeno, así como la α-­D-­ lactosa, inductora de enzimas celulolíticas pero asimilada pobremente por los hongos. También fue capaz de antagonizar e inhibir el crecimiento in vitro de hongos y oomicetes fiotpatógenos de los géneros Colletotrichum y Phytophthora, respectivamente, así como de decolorar colorantes fenólicos y agua residual de la industria papelera. Se detectó la actividad extracelular de las enzimas ligninolíticas lacasa (LAC), manganeso peroxidasa (MnP) y lignin peroxidasa (LiP) en la cepa CMU-­196. Sin embargo, evidencia genómica y proteómica generada por otros grupos de investigación durante el desarrollo del presente trabajo mostró que los ascomicetes no poseen genes que codifiquen para MnP y LiP. El rastrojo de maíz incrementa la actividad de LAC extracelular de la cepa CMU-­196 con respecto a medio caldo de papa basal, y ensayos de fermentación en sustrato sólido mostraron que la cepa de interés delignifica significativamente dicha biomasa, mejorando su digestibilidad ruminal in vitro. La LAC extracelular purificada de la cepa de estudio mostró una masa molecular de 98 kDa y condiciones catalíticas óptimas a pH 4.5 y 60 °C, con alta afinidad por ABTS y dimetoxifenol (DMP). La secuencia de aminoácidos de la LAC extracelular de la cepa CMU-­196 obtenida in silico presenta los motivos de una lacasa sensu stricto de ascomicetes y el análisis filogenético muestra una estrecha relación con las enzimas de Paraconiothyium sporulosum y del ascomicete fitopatógeno Fusarium oxysporum.