Expresión de la proteína HSP65 de Mycobacterium leprae en tabaco y su efectividad como tratamiento oral en ratas artríticas

Abstract

Based expression systems in plants provide an adequate means to produce immunogenic molecules that could be used as oral vaccines. The tobacco (Nicotiana tabacum), in particular, has been one of the best model systems in this field, since research has shown that a wide variety of foreign proteins can be expressed efficiently in this plant, due to the processing system well established that account. The aim of this study was to obtain transgenic tobacco plants that express the protein HSP65 promoter under the control of double 35S cauliflower mosaic virus (CaMV) and assess its effectiveness in the oral treatment of rats with adjuvant induced arthritis. . Agrobacterium tumefaciens bearing the pChsp65 plasmid was used to transform tobacco plants. The plantules obtained were selected for resistance to the antibiotic kanamycin, and histochemical evidence for the expression of the enzyme ?-glucuronidase. Complete tobacco plants were obtained, to which they verified the incorporation of the hsp65 gene was confirmed by PCR, RT-PCR, histochemistry and western blot analyzes. Six regenerated lines were selected (7, 9, 20, 31, 33, 34) and these lines was extracted total DNA and RNA for PCR and RT-PCR in which amplification was verified by a band of 1644 bp corresponding to the expected size. Likewise, in the Western blot, we observed the presence of a protein of 65 kDa molecular weight. The expression levels were determined by densitometry. To test the efficiency of antigen produced in tobacco, were treated orally to Lewis rats with tobacco leaf arthritic transgenic line 34.

Los sistemas de expresión basados en plantas brindan un medio adecuado para producir moléculas inmunogénicas que podrían ser utilizadas como vacunas orales. El tabaco (Nicotiana tabacum), en particular ha sido uno de los mejores sistemas modelo en este campo, ya que diversas investigaciones han demostrado que una amplia variedad de proteínas foráneas puede ser expresada eficientemente en esta planta, debido al sistema de transformación bien establecido con que se cuenta. El objetivo de este trabajo fue obtener plantas transgénicas de tabaco que expresaran la proteína HSP65 bajo el control del promotor doble 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y evaluar su eficacia por vía oral en el tratamiento de ratas con artritis inducida por adyuvante. Se transformaron discos de hojas de tabaco con el plásmido pChsp65 vía Agrobacterium tumefaciens. Las plántulas obtenidas se seleccionaron por resistencia al antibiótico kanamicina, y por la prueba histoquímica de la expresión de la enzima ?-glucuronidasa. Se obtuvieron plantas completas de tabaco, a las cuales se les verificó la incorporación del gen de la proteína HSP65 por análisis tipo PCR, RT-PCR y Western Blot. Se seleccionaron seis líneas regeneradas (7, 9, 20, 31, 33, 34) y éstas líneas se realizó extracción de ADN y ARN total para las pruebas de PCR y RT-PCR en las que se verificó la amplificación de una banda de 1644 pb correspondiente al tamaño esperado. Así mismo, en la prueba de western blot, se observó la presencia de una proteína de 65 KDa correspondiente al peso molecular del péptido HSP65. Los niveles de expresión fueron determinados por densitometría. Para comprobar la eficacia del antígeno producido en tabaco, se trataron vía oral a ratas Lewis artríticas con hoja de tabaco transgénico de la línea 34.