Estudios sobre la regulación por fosforilación de la proteína PSIF de humano

Abstract

One of the genes involved in the regulation of the cell cycle is the psif gene. This gene has a transcriptional expression pattern limited to the G2 / M transition of the cell cycle, and its absence decouples the division. Such facts indicate that the expression of psif is required only for this transition stage during the cycle and is indispensable for its normal progression. The induction of psif in cell cultures inhibits the specific protein synthesis of the transition from G2 to M and in view of this inhibitory function and its essentiality in the cell cycle, it is vitally important to know how the PSIF protein is regulated. By bioinformatic analysis of the amino acid sequence of PSIF, probable phosphorylation sites were found for different kinases involved in cell cycle regulation, which suggests that the PSIF protein is phosphorylated by some of these kinases. As a first step, sucking of the psif gene was performed in high-expression vectors in Escherichia coli (Top10) and Schizosaccharomyces pombe (TCP1). Subsequently, gene expression was induced in cell cultures of both strains for recombinant protein analysis through denaturing electrophoresis and immunodetection assays. When attempting to overexpress human PSIF protein in yeast cultures, it was found that the protein could not be induced beyond baseline expression levels, without obtaining a negative effect on cell growth. This effect was corroborated by optical density analysis in spectrophotometry at 600 nm, finding a 75% reduction in S. pombe cell growth in samples containing the psif gene, whether or not it induced its expression.

Uno de los genes implicados en la regulación del ciclo celular es el gen psif. Este gen tiene un patrón de expresión transcripcional circunscrito a la transición G2/M del ciclo celular, y su ausencia desacopla la división. Tales hechos indican, que la expresión de psif es requerida sólo para esta etapa de transición durante el ciclo y es indispensable para la progresión normal del mismo. La inducción de psif en cultivos celulares inhibe la síntesis de proteínas específica de la transición de G2 a M y ante está función inhibidora y su esencialidad en el ciclo celular, resulta de vital importancia conocer la manera en que la proteína PSIF es regulada. Mediante análisis bioinformáticos de la secuencia aminoacídica de PSIF se encontraron sitios probables de fosforilación por distintas cinasas implicadas en la regulación del ciclo celular, lo cual sugiere que la proteína PSIF es fosforilada por alguna de estas cinasas. Como primer paso, se realizó la sucblonación del gen psif en vectores de alta expresión en Escherichia coli (Top10) y Schizosaccharomyces pombe (TCP1). Posteriormente, se indujo la expresión del gen en cultivos celulares de ambas cepas para el análisis de la proteína recombinante por medio de ensayos de electroforesis desnaturalizante e inmunodetección. Al intentar sobreexpresar la proteína PSIF de humano en cultivos de levadura, se encontró que la proteína no pudo ser inducida más allá de los niveles de expresión basal, sin obtener un efecto negativo en el crecimiento celular. Dicho efecto se corroboró por análisis de densidad óptica en espectrofotometría a 600 nm, encontrando una reducción del 75% en el crecimiento celular de S. pombe en las muestras que contienen el gen psif, ya sea induciendo o no su expresión.