ChrA is a membrane protein that confers resistance to oxyanion chromate in Pseudomonas aeruginosa, through the expulsion of chromate to the cellular exterior. The topology of ChrA in the membrane consists of 13 transmembrane segments (STMs), joined by six cytoplasmic handles (C1-C6) and six periplasmic handles (P1-P6). ChrA belongs to the family of LCHR transporters, to which the ChrA protein of Cupriavidus metallidurans and 75 other uncharacterized homologous proteins also belong. Using the site-directed mutagenesis technique, some neutral and basic residues essential for the functioning of ChrA were identified, to which a structural or functional role has been assigned. The objective of this work was to identify acidic residues (Aspartate and Glutamate) essential for the functioning of the ChrA protein. The selection of acid residues as a target of directed mutagenesis was made taking into account those residues that had a negative charge conservation equal to or greater than 50% in ChrA homologues. In total, eight acid residues were mutated by Alanine. The mutants obtained were subjected to chromate susceptibility tests, determining from this test the essentiality for ChrA of the mutated residues. The Glu60, Glu230 and Asp281 residues (located in hydrophilic handles) were shown not to be important for the functioning of ChrA. The Asp59 residue (located in the P1 loop) was found to be important for protein functioning. The Glu56 residue (located in the periplasmic loop P1), as well as the Glu83, Glu86 and Asp162 residues (located in STMs), were found to be essential for the functioning of the ChrA protein. The results indicate that ChrA's P1 handle is an important participant in the chromate expulsion process.
ChrA es una proteína de membrana que confiere resistencia al oxianión cromato en Pseudomonas aeruginosa, a través de la expulsión del cromato al exterior celular. La topología de ChrA en la membrana consiste de 13 segmentos transmembranales (STMs), unidos por seis asas citoplásmicas (C1-C6) y seis asas periplásmicas (P1-P6). ChrA pertenece a la familia de transportadores LCHR, a la cual también pertenece la proteína ChrA de Cupriavidus metallidurans y otras 75 proteínas homólogas no caracterizadas. Empleando la técnica de mutagénesis sitio dirigida se identificaron algunos residuos neutros y básicos esenciales para el funcionamiento de ChrA, a los cuales se les ha asignado un papel estructural o funcional. El objetivo de este trabajo fue identificar residuos ácidos (Aspartato y Glutamato) esenciales para el funcionamiento de la proteína ChrA. La selección de residuos ácidos como blanco de mutagénesis dirigida se hizo tomando en cuenta aquellos residuos que presentaran una conservación de su carga negativa igual o mayor al 50% en homólogos de ChrA. En total se mutaron ocho residuos ácidos por Alanina. Las mutantes obtenidas fueron sometidas a pruebas de susceptibilidad a cromato, determinándose a partir de este ensayo la esencialidad para ChrA de los residuos mutados. Los residuos Glu60, Glu230 y Asp281 (ubicados en asas hidrofílicas) mostraron no ser importantes para el funcionamiento de ChrA. El residuo Asp59 (ubicado en el asa P1) resultó ser importante para el funcionamiento de la proteína. El residuo Glu56 (ubicado en el asa periplásmica P1), así como los residuos Glu83, Glu86 y Asp162 (ubicados en STMs), resultaron ser esenciales para el funcionamiento de la proteína ChrA. Los resultados indican que el asa P1 de ChrA participa de manera importante en el proceso de expulsión de cromato.
