Transformación genética de Phalaenopsis amabilis Blume Var. Luchia Lady (Orchidaceae) con el gen de la ß-1, 3-glucanasa

Abstract

Phalaenopsis amabilis is an orchid of great commercial importance, which has become widely cultured in different countries. Due to having slow growth rates, fungal attack and specially the infection by Fusarium oxysporum in early growth stages of P. amabilis have led to significant economic losses in the ornamental field. In the present work, transgenic seedlings of P. amabilis var. “Luchia Lady” were successfully produced by Agrobacterium tumefaciens, carrying a plasmid containing the class III β-1,3-glucanase gene PR-Q’ and selectable markers nptII and uidA. Leaf and stem segments produced Protocorm-Like-Bodies (PLB’s) in MS medium with 0.5 mg/l ANA y 1.0 mg/l GA3, containing 150 mg/l de kanamycin. Antibiotic-resistant PLB’s were cultivated individually in MS medium with 0.5 mg/l GA3 to produce well developed seedlings corresponding to 115 plant lines. Transformation of plantlets with PR-Q’ was confirmed by PCR analysis in lines 64, 69, 79 and 115, which were also positive in GUS assays. Transgenic lines showed strong levels of growth inhibition in F. oxysporum mycelium, suggesting that genetic transformation conferred resistance to Fusariosis in P. amabilis.

Phalaenopsis amabilis es una orquídea de gran demanda comercial alrededor del mundo, cuyo cultivo se realiza de forma masiva en diferentes países. Dado que su ciclo de vida es largo, el ataque de hongos, y particularmente la infección por Fusarium oxysporum en etapas tempranas de desarrollo ponen en riesgo la producción de esta planta de interés ornamental. En el presente trabajo, plántulas de P. amabilis var. Luchia Lady fueron transformadas por Agrobacterium tumefaciens con el gen PR-Q’, que codifica para una β-1,3-glucanasa clase III. Explantes de hojas y bases de tallo fueron sometidos a cocultivo con la cepa LBA4404 de A. tumefaciens, conteniendo el gen PR-Q´, el gen marcador nptII y el gen reportero uidA. Los explantes generaron protocormos en medio MS con 0.5 mg/l ANA y 1.0 mg/l GA3 con 150 mg/l de kanamicina como antibiótico de selección. Los protocormos resistentes a kanamicina fueron cultivados de forma individual en medio MS con 0.5 mg/l GA3 para obtener plantas bien desarrolladas, obteniendo así 115 líneas. La transformación genética fue confirmada en las líneas 64, 69, 79 y 115 mediante el análisis de la actividad histoquímica de la β- glucuronidasa, y del análisis por PCR para amplificar el gen PR-Q’. Las líneas transformadas presentaron altos niveles de inhibición en el crecimiento de micelio de F. oxysporum, lo cual sugiere que la transformación genética confirió resistencia a la fusariosis en P. amabilis.